论文部分内容阅读
本研究在自行成功研制的鼠抗人CD40激发型单克隆抗体(5C11)和鼠抗人muCD40单克隆抗体(5H6)的基础上,采用嵌合抗体构建方法,在真核细胞293T中实现表达,通过计算机辅助设计方法提高嵌合抗体表达量,并对嵌合抗体生物学功能进行初步研究。第一部分:CD40人-鼠嵌合抗体的构建、表达及功能初步研究从5C11杂交瘤细胞中抽取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增,钓取重链Fd及轻链基因。根据重、轻链基因序列设计引物,应用PCR方法扩增VH和VL基因。双酶切装载有信号肽序列及人IgG1γ链的Fc、CH1基因的重链表达载体pCMV-VH以及装载有信号肽序列及κ链的Cκ基因的轻链表达载体pCMV-VL。将同样双酶切的VH和VL基因连接入表达载体,构建成嵌合抗体(ch5C11)的轻链真核表达载体5C11L-pCMV及重链真核表达载体5C11H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中c5C11的浓度,利用流式细胞术检测c5C11与膜抗原的特异性结合。选择天然高表达CD40分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi(阳性表达率>90%)与ch5C11共培养,镜下观察细胞生长形态, CCK-8分析ch5C11对Daudi细胞的生长与存活的影响。研究结果表明:成功构建了分别含嵌合重、轻链基因的真核表达载体5C11H-pCMV及5C11L-pCMV,并在293T细胞中得到瞬时表达。ch5C11能够有效识别Daudi细胞膜型CD40分子。ch5C11能有效抑制Daudi细胞体外增殖。提示CD40嵌合抗体具有良好的生物学活性。通过计算机辅助设计方法对c5C11的氨基酸序列进行改造,分析并设计突变影响嵌合抗体表达量的氨基酸。将改造后的轻链表达载体5C11L-pCMV及重链表达载体5C11H(M)-pCMV共转染的293T细胞。利用夹心ELISA法测定上清中ch5C11的浓度,利用流式细胞术检测ch5C11与膜抗原的特异性结合。选择天然高表达CD40分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi(阳性表达率>90%)与ch5C11(M)共培养,镜下观察细胞生长形态, CCK-8分析ch5C11(M)对Daudi细胞的生长与存活的影响。结果表明:ch5C11(M)表达量有较显著的提高。ch5C11(M)能够有效识别Daudi细胞膜型CD40分子。ch5C11能有效抑制Daudi细胞体外增殖。提示CD40嵌合抗体具有良好的生物学活性。第二部分:muCD40人-鼠嵌合抗体的构建、表达及功能初步研究从5H6杂交瘤细胞中抽取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增,钓取重链Fd及轻链基因。根据重、轻链基因序列设计引物,应用PCR方法扩增VH和VL基因。双酶切装载有信号肽序列及人IgG1γ链的Fc、CH1基因的重链表达载体pCMV-VH以及装载有信号肽序列及κ链的Cκ基因的轻链表达载体pCMV-VL。将同样双酶切的VH和VL基因连接入表达载体,构建成嵌合抗体(ch5H6)的轻链真核表达载体5H6L-pCMV及重链真核表达载体5H6H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中ch5H6的浓度,利用流式细胞术检测ch5H6与膜抗原的特异性结合。综上所述:1、成功构建了抗人CD40人-鼠嵌合抗体(ch5C11)。2、CD40嵌合抗体可有效抑制天然高表达CD40分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi的体外增殖。3、通过计算机辅助设计方法对ch5C11的氨基酸序列进行改造后,瞬时表达量明显提高。该抗体在某些肿瘤的免疫治疗及移植抗排异中具有潜在的应用价值。4、成功构建了抗人muCD40人-鼠嵌合抗体(ch5H6)。这两株工程化抗人CD40抗体的研制,为CD40抗体在肿瘤治疗及诊断中的应用研究,奠定了厚实的基础。