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研究目的1.通过二代测序技术筛选三阴性乳腺癌细胞系中CENP-U差异表达相关基因和血管生成相关基因。2.通过体外实验,在MDA-MB-231和CAL51中建立CENP-U稳定表达细胞系,分析CENP-U基因在不同细胞系中的表达情况及对血管形成的作用。3.通过体内实验,分析小鼠乳腺癌模型中CENP-U基因与血管生成因子的相关性及对血管形成的影响。研究方法1.运用二代测序技术分析基因功能;分析基因与疾病的关系;分析基因组、化学和系统功能信息;分析人类各项反应及生物学通路。测序分析:提取总RNA,然后m RNA富集,双连c DNA合成,之后末端修复,加A和接头,选出预测片段后,进行PCR扩增,并建立文库,后二代测序仪测序。2.采用实时定量PCR方法检测不同细胞系中CENP-U在m RNA水平表达情况,通过Western blotting检测不同细胞系中的CENP-U在蛋白水平表达情况。3.通过转染质粒,在MDA-MB-231和CAL51中构建稳定表达CENP-U细胞稳系,设置对照组(vector组)和降表达组(sh CENP-U组)。采用MTT比色法和平板克隆实验检测细胞稳系中不同组间细胞的增殖和克隆情况。4.采用划痕实验检测细胞稳系中不同组间细胞的迁移能力。通过小管形成实验(Tube Formation),利用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分别在MDA-MB-231和CAL51细胞稳系中检测对照组和降表达CENP-U组的小管形成情况。5.分别提取MDA-MB-231和CAL51细胞稳系的蛋白,采用Western blotting方法分别检测对照组和降表达组的VEGFA和HIF-1A蛋白水平;采用实时定量PCR方法分别检测对照组和降表达组的PTGS2的m RNA水平,Western blotting方法检测PTGS2蛋白水平。6.裸鼠成瘤建模后,采用ELISA方法分别检测对照组和降表达组小鼠血清中的VEGFA的表达量。7.裸鼠成瘤建模后,提取实体瘤的蛋白,采用Western blotting方法分别检测对照组和降表达组与VEGFA、HIF-1A、p AKT和STAT3的表达量。8.裸鼠成瘤建模后,取小鼠肿瘤,采用免疫组织化学方法,检测对照组和降表达组的VEGFA、HIF-1A、CD31和CD34在瘤体组织中的表达情况。结果1.通过二代测序分析,筛选出与降表达CENP-U相关的基因共3223个,与过表达CENP-U相关的基因共266个,其中重叠交叉基因105个:IL1RL1/RP11-875O11.3/HIST1H4H/RP11-161I2.1/ABCC9/RELB/HIST1H2AC/CA9/ATF3/TNFRSF9/IL32/HIST1H2BJ/EGR2/IL1A/MUC5B/TNFAIP3/AQP1/PLA2G4C/NEURL3/RND1/FILIP1L/LINC00944/CENPU/HIST1H2BC/ZNF641/EFTUD1P1/OSGIN1/MIR210HG/MZT1/ALOXE3/VLDLR-AS1/PPFIA4/NR1D1/GGT5/HIST1H2BD/CPLX1/HSPB8/LUCAT1/CYP1B1/HIST1H1C/SSC5D/GADD45G/PTGS2/INSC/EGR1/BTF3L4/HIST2H2BE/ITGB3/INHBB/SSPO/F GF21/LFNG/NCF2/ARC/HIST1H2BN/GSKIP/RP11-467L13.5/ARHGDIB/PIWI L2/OLFML2A/P4HA3/RP11-301G19.1/FLT1/ANKFN1/SPANXB1/SPNS3/TRA F1/BIRC3/RP11-1055B8.4/CD22/LINC00622/NTM/IFIT2/MRPS24/SCD/OVGP1/CD163L1/BMP6/NGF/ALG5/ANGPT2/LURAP1L-AS1/PAIP1/TOLLIP-AS1/MIPEPP3/AFP/MYO5B/NFKBIE/LGALS9C/CYP4F26P/RP11-430C7.5/DDX60/RAET1L/SREBF1/S100A1/FAM71F2/SNX16/LAIR2/RNF224/GRIK5/PLCXD1/AKNAD1/RP11-88I21.1/HKDC1/ITGB2。筛选出与CENP-U降表达和过表达同时相关的基因9个:CD22,PTGS2,IFIT2,NR1D1,NGF,DDX60,其余2个基因为无意义基因,另一个是CENP-U本身。2.富集分析发现CENP-U变化后有106个与血管生成相关的基因发生变化:HSPG2/AQP1/EPHB2/TGFB2/NRP1/CAV1/ITGB3/ADGRG1/ADGRA2/NOTC H3/THBS1/FGF18/CSPG4/NOV/PLXND1/LOXL2/COL8A1/ADGRB2/PRKCA/JAG1/IHH/F3/ADM2/PLAU/BRCA1/COL4A2/FLT1/C5/CCBE1/MMP19/EMP2/APOLD1/HIF-1A/FN1/CYP1B1/TGFBI/E2F7/RAMP1/COL4A1/SOX18/MC AM/PNPLA6/ADRB2/EFNB2/DLL4/HIPK2/ATPIF1/VEZF1/TBX1/BMPER/SA SH1/EDN1/E2F8/FGF8/PDGFRB/HIPK1/GATA2/ANGPT2/MTDH/C5AR1/EL K3/SPARC/IL1A/GNA13/ANGPTL4/NFATC3/SEMA3E/WNT7B/SPHK1/PAXI P1/BAK1/ROBO1/CRHR2/NFATC4/NR4A1/WNT5A/EPHB3/LAMA5/LEF1/A DAM8/PTK2/UBP1/CD34/GTF2I/MAP2K5/ROCK1/WARS/ARHGAP22/PTGS2/KLF5/HPSE/TEAD2/PIK3CB/NOTCH4/FMNL3/PTPRM/VEGFA/ITGB1/EIF2AK3/EGFL7/TNFRSF12A/PLXDC1/TNFAIP3/ERAP1/BMP4/PIK3CG.。3.构建CENP-U引物,验证准确后,分别在多个细胞系中行实时定量验证,发现在MCF-7和CAL-51和MDA-MB-231三个细胞系中CENP-U的m RNA含量较高;分别在多个细胞系中行Western blotting检测,发现在MCF-7和CAL51和MDA-MB-231和CAL/DOX的细胞系中CENP-U的蛋白含量较高。4.分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行MTT比色法实验,测OD值后,分别绘制对照组(vector组)和降表达组(sh CENP-U组)的细胞生长曲线,结果显示降表达组的细胞增殖活性明显低于对照组,降表达组的细胞增殖能力明显减弱;分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行平板克隆实验,细胞计数后,分别绘制对照组和降表达组的细胞生长曲线,结果显示降表达组的细胞克隆数量明显低于对照组,从而表明降表达组的细胞克隆能力明显减弱。5.分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行划痕实验,结果显示降表达组的细胞迁移能力明显慢于对照组,降表达CENP-U的细胞迁移能力明显减弱。小管形成实验显示:在CAL51稳系中降表达CENP-U组的小管形成分支长度明显少于对照组;在MDA-MB-231稳系中降表达CENP-U组的小管形成分支长度明显少于对照组,降表达CENP-U后,小管形成能力明显减弱。6.分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行Western blotting检测,结果显示:降表达CENP-U后,与血管生成相关的VEGFA和HIF-1A蛋白表达水平也降低;分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行实时定量PCR检测,结果显示:CENP-U的m RNA表达水平降低后,PTGS2的m RNA表达水平也降低;分别在CAL51和MDA-MB-231稳系中行Western blotting检测,结果显示:CENP-U的蛋白表达水平降低后,PTGS2的蛋白表达水平也降低。7.裸鼠建模成功后,绘制生长曲线,结果显示降表达组的瘤体生长速度慢于对照组,降表达组的瘤体体积小于对照组的瘤体体积,降表达CENP-U后,肿瘤细胞增殖能力明显减弱;取活体小鼠的血清行ELISA检验,结果显示降表达CENP-U组的VEGFA的表达水平明显低于对照组,降表达CENP-U后,VEGFA的表达量也降低。8.裸鼠瘤体组织的免疫组织化学显示:降表达组(sh CENP-U)的VEGFA阳性表达明显低于对照组;降表达组的HIF-1A阳性表达明显低于对照组;降表达组的CD31阳性表达明显低于对照组;降表达组的CD34阳性表达明显低于对照组。提取裸鼠瘤体组织的蛋白,测蛋白浓度后,行Western blotting检测,结果显示:降表达CENP-U后,与血管生成相关的VEGFA、HIF-1A、p AKT和STAT3蛋白水平也显著降低。结论1.利用二代测序技术,通过富集分析,发现CENP-U与肿瘤血管生成密切相关。2.在三阴性乳腺癌细胞系和动物模型中证实CENP-U可以影响血管生成因子的表达。3.CENP-U可以影响三阴性乳腺癌的血管生成。