目的:1.大样本染色体数据库回顾性分析8p11重排的发生情况,并应用双色荧光分离探针检测8p11阳性患者的FGFR1基因重排,鉴定FGFR1对手基因,对断裂位点进行精确定位,并分析其临床特点及实验室特征;对FGFR1重排标本进行高通量DNA基因测序,筛查此类患者有无协同基因事件,并比较此类事件在其他血液肿瘤的发生情况。2.从一例伴der(8)inv(8)(p11q22)的急性白血病的研究入手,克隆FGFR1新融合基因RBPMS-FGFR1,并对其进行初步功能研究,同时克隆ZNF198-FGFR1融合基因作为阳性对照,以深化我们对FGFR1相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识。3.信号通路靶向药物Voxtalisib及三氧化二砷对KG-1细胞的抑制效应。方法:1.应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)对30例伴有8p11异常的原发血液病患者进行FGFR1基因重排筛选,并分析其临床及实验室特征;通过比较基因杂交、转录组测序、逆转录PCR及测序等技术扩增FGFR1的对手基因并精确定位;通过二代测序技术鉴定FGFR1重排的伴随基因事件。2.设计引物并利用KOD高保真酶扩增出RBPMS-FGFR1融合基因全长,分别将ZNF198-FGFR1及RBPMS-FGFR1两个融合基因全长克隆到慢病毒载体LV5;采用慢病毒包装体系包装ZNF198-FGFR1及RBPMS-FGFR1病毒,并用病毒侵染小鼠原B细胞BaF3细胞株,成功构建过表达ZNF198-FGFR1及RBPMS-FGFR1稳转细胞株,通过Western Blot验证蛋白表达情况,绘制生长曲线,通过IL-3撤退、细胞凋亡检测、信号通路检测等情况观察这些融合基因对BaF3细胞的影响。3.通过ATP-CRA技术检测KG-1细胞对小分子靶向药物、去甲基化药物及传统化疗药物敏感性,通过CCK8检测增殖抑制效应,流式检测细胞凋亡,通过实时定量PCR检测凋亡相关基因、Western Blot检测信号通路抑制情况、集落形成检测药物抑制效率。结果:1.伴随8p11/FGFR1重排患者的临床及实验室特征30例伴有8p11异常患者中,有25例患者标本充足,经检测FGFR1基因重排阳性者有8例(32.0%)。其中,男性6例,女性2例,8例患者的平均年龄为40岁(9–65岁),均表现为外周白细胞水平增加,平均为42.16×10~9/L(21.69–76.0×10~9/L)。骨髓形态表现为髓系造血明显活跃,其中5例患者(62.5%)同时合并显著的嗜酸细胞增多(嗜酸细胞大于6%)。共扩增到5种对手基因,分别为:CEP110、ZNF198、BCR、MYO18A及新对手基因RBPMS。精确定位发现FGFR1断裂位点均位于9到10号外显子。第二代基因测序发现RUNX1基因突变是其唯一伴随事件。2.RBPMS-FGFR1融合基因的克隆及功能研究应用FISH技术、比较基因组杂交芯片、RT-PCR和基因测序技术对其中1例患者白血病细胞der(8)inv(8)(p11q22)的断裂点进行精确定位,克隆到一个新的累及RBPMS和FGFR1的融合基因,RBPMS-FGFR1。该融合基因由RBPMS的1-5号外显子和FGFR1的10-19号外显子融合而成,且有两种断裂融合位点。通过分子克隆及细胞培养技术,将携带ZNF198-FGFR1及RBPMS-FGFR1慢病毒载体的质粒转染BaF3细胞,对其生物学特性进行检测后发现,ZNF198-FGFR1融合基因可使BaF3细胞获得IL-3非依赖性,转染RBPMS-FGFR1后BaF3细胞生长仍依赖IL-3。Western Blot结果显示,ZENF198过表达以及RBMPS过表达均可以不同程度的促进Akt,STAT3和STAT5的磷酸化,同时抑制AMPK的磷酸化,但是对ERK1/2磷酸化水平无影响。通过ATP-CRA进行肿瘤药物敏感性检测发现,三氧化二砷对携带ZNF198-FGFR1及RBPMS-FGFR1基因的BaF3细胞均有明显的抑制效应。3.Voxtalisib及三氧化二砷对KG-1细胞的药物抑制实验研究我们使用临床上常见的化疗药物及新型的小分子靶向药物,分为两组进行加药实验,结果显示KG-1细胞对去甲氧柔红霉素、地西他滨、AZD4547、TAK733等药物表现出明显的耐药性,对Voxtalisib、BGJ398、Ponatinib、HHT及三氧化二砷则较为敏感。将不同浓度的Voxtalisib及三氧化二砷加入KG-1细胞共培养,通过CCK8测定450nm处吸收光度值。结果显示,Voxtalisib及三氧化二砷对KG-1细胞均有显著抑制效应,且呈现浓度依赖性。集落形成实验分析显示,Voxtalisib及三氧化二砷均可以抑制KG-1细胞集落形成,两药联合后抑制效应更加明显,差异显著(P<0.05)。流式细胞检测发现,Voxtalisib及三氧化二砷均有促进KG-1凋亡增加的作用。实时定量PCR及Western Blot检测凋亡相关基因及蛋白表达,同时检测PI3K信号通路相关蛋白p-PI3K和p-Akt表达变化。结果提示,Voxtalisib(S7646)和三氧化二砷均可以调节Bcl2和Caspase3的蛋白表达水平,同时抑制PI3K和Akt的磷酸化水平。结论:1.本研究通过对恶性血液病中FGFR1基因重排进行FISH筛选,发现8p11骨髓增殖综合征(EMS)发生率低,在恶性血液病中相对罕见。所有EMS患者均表现为外周白细胞水平增加,骨髓形态表现为髓系造血明显活跃,多数同时合并显著的嗜酸细胞增多。FGFR1常见对手基因有:ZNF198、CEP110、BCR等。经二代测序证实,RUNX1基因突变在EMS中的发生率高达66.7%,明显高于骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病组,且所有CEP110-FGFR1阳性的EMS患者中均同时携带RUNX1基因突变,提示RUNX1突变可能在EMS的发病及疾病进展中扮演重要角色。2.发现一种涉及FGFR1重排基因的新获得性染色体易位:der(8)inv(8)(p11q22)。该易位基因组水平的断裂点分别位于FGFR1第10个外显子及RBPMS第5号外显子之间。通过构建携带ZNF198-FGFR1、RBPMS-FGFR1的慢病毒载体,获得稳定高表达ZNF198-FGFR1、RBPMS-FGFR1的BaF3细胞系,体外研究发现,ZNF198-FGFR1融合基因可使BaF3细胞获得IL-3非依赖性,而转染新融合基因RBPMS-FGFR1的Ba F3仍需要依赖IL-3。上述三种融合基因的过表达均可以不同程度的促进Akt,STAT3和STAT5的磷酸化,同时抑制AMPK的磷酸化,但是对ERK1/2磷酸化水平没有影响。ATP-CRA技术检测细胞敏感药物实验显示,三氧化二砷对ZNF198-FGFR1、RBPMS-FGFR1感染组细胞株均显示出较好的抑制效应,值得进一步探讨。3.Voxtalisib及三氧化二砷对KG-1细胞均表现出较好的抑制效应,其机制可能与调节Bcl2、Caspase3水平及PI3K/Akt信号通路相关。