论文部分内容阅读
目的利用永生化人支气管上皮BEAS-2B细胞为研究对象进行低浓度纳米钴颗粒(Co nanoparticles,Nano-Co)慢性刺激,观察Nano-Co长期处理诱导细胞发生低氧损伤、DNA双链断裂损伤和基因组不稳定性及同源重组修复因子Rad52表达变化,初步探讨HIF-1α/mi R-210靶向抑制同源重组修复因子Rad52在Nano-Co诱导细胞转化中的作用及可能的机制,为Nano-Co的安全性评价提供可靠的科学依据。方法1.免疫荧光染色法检测DNA双链断裂损伤位点(foci)的形成,Western blot检测γ-H2AX的表达水平。观察低剂量Nano-Co长期处理对BEAS-2B细胞DNA双链断裂损伤的影响。2.胞质分裂阻滞微核细胞组学试验分析Nano-Co长期刺激对BEAS-2B细胞染色体稳定性的影响。3.q PCR、Western blot检测对照组和0.05μg/m L、0.1μg/m L Nano-Co处理15周后细胞同源重组修复因子Rad52 m RNA和蛋白的表达情况。4.qPCR、Western blot检测细胞mi R-210水平和HIF-1α蛋白的表达情况,分析低剂量Nano-Co长期刺激对HIF-1α/mi R-210通路的活化作用。5.应用mi R-210 mimics及inhibitor质粒转染细胞的方法调节mi R-210的表达水平,q PCR、Western blot检测细胞Rad52 m RNA和蛋白的表达情况。6.双荧光素酶报告基因检测系统验证mi R-210与Rad52之间靶标关系。结果1.细胞免疫荧光染色结果显示:实验组中DNA双链断裂损伤位点(foci)明显多于对照组;Western blot结果显示:实验组细胞γ-H2AX水平显着升高(P<0.05)。2.胞质分裂阻滞微核细胞组学试验分析结果显示:实验组细胞的微核数较对照组显著增多(P<0.05),并见核芽和核质桥。3.qPCR、Western blot结果显示:0.05μg/mL、0.1μg/mL Nano-Co处理15周后的实验组细胞Rad52 m RNA和蛋白水平均明显低于对照组(P<0.05)。4.Western blot、q PCR结果显示:0.05μg/m L和0.1μg/m L Nano-Co处理15周后的实验组细胞HIF-1α和mi R-210水平显著高于对照组(P<0.05)。5.瞬时转染mi R-210 mimics,inhibitor,NC质粒至Nano-Co转化细胞,调控mi R-210的水平,q PCR和Western blot检测RAD52 m RNA及蛋白表达水平,结果显示:mimic组低于对照组、NC组(P<0.05);inhibitor组明显高于对照组、NC组(P<0.05)。6.双荧光素酶报告基因结果显示:mi R-210 inhibitor相对于mi R-210 inhibitor NC能上调野生型报告基因载体荧光素酶的活性(P<0.05),而空载和突变型载体无明显变化。结论1.明确了Nano-Co长期刺激可引发细胞DNA双链断裂损伤及基因组的不稳定性。2.明确了Nano-Co长期刺激可引起细胞低氧损伤及同源重组修复因子Rad52的表达下调。3.Nano-Co长期处理促进HIF-1α/mi R-210通路的活化及Rad52表达受抑是Nano-Co致细胞基因组不稳定性的重要影响因素,我们的研究进一步证实Nano-Co长期刺激具有潜在的致癌性。