草药分子鉴定:从条形码到基因组

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药用植物种类繁多、来源复杂,同名异物、同物异名等现象普遍。中药材是中药饮片、中药提取物和中成药的原料,中药材的准确鉴定是中医药事业运行和发展的基本环节。DNA条形码是传统形态鉴别方法的有效补充,是近年来生物分类和物种鉴定的研究热点。如今,DNA条形码技术已广泛应用于中药鉴定、系统分类、发育进化、生物多样性保护等各个领域。本研究对《美国药典》膳食补充剂基原物种、畲药食凉茶、中药材王不留行及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,同时利用高通量测序技术测定了薯蓣和叉蕊薯蓣叶绿体基因组,获得主要结果及结论如下:(1)本研究共获得《美国药典》膳食补充剂28科49种48个药材127份样品的ITS2和psbA-trnH序列共227条,占《美国药典》膳食补充剂所有收载药材的98%。ITS2序列扩增和测序效率分别为75.6%和100%。多基原药材对其psbA-trnH序列进行扩增,35份样品DNA获得psbA-trnH序列共31条,序列扩增效率为88.6%。ITS2和psbA-rnH的物种水平鉴定效率分别为78.2%和38.3%。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示每个膳食补充剂基原物种分别聚为一支,彼此间能很好的区分。利用ITS2和psbA-trnH序列建立了《美国药典》膳食补充剂DNA条形码数据库,为保证其临床用药的准确性和安全性奠定了基础。(2)应用ITS2序列对传统畲药食凉茶基原物种柳叶蜡梅和浙江蜡梅及其近缘种共7个物种71个研究对象进行鉴定研究,共获得ITS2序列71条。结果表明畲药食凉茶基原物种种内K2P距离较小,种间K2P遗传距离为0.004~0.078,两个物种的平均GC含量分别为71.23%和71.07%。食凉茶基原物种柳叶蜡梅和浙江蜡梅在NJ树中聚为一支,能有效地与其他近缘物种区分开。ITS2序列作为DNA条形码能鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘种,为保障畲药的临床安全用药提供了新的技术手段。(3)基于ITS2序列对中药材王不留行种子及其混伪品共6个物种85个研究对象进行鉴定研究。王不留行ITS2序列长度为219-221bp,GC含量56.6%,种内最大K2P遗传距离为0.009,小于其与混伪品的种间K2P遗传距离,王不留行及其混伪品ITS2序列间存在的变异位点较多。NJ树结果表明王不留行与其混伪品分别聚为一支,可明显区分ITS2序列可以准确鉴别王不留行种子,为其种质资源鉴定和中药材种子质量标准的建立提供了新方法。(4)利用高通量测序技术测定了薯蓣(Dioscorea opposita)、叉蕊薯蓣(D.collettii)叶绿体基因组,完成了其物理图谱绘制,基因组结构特征解析,基因功能分类等。薯蓣和叉蕊薯蓣叶绿体基因组总长度分别为152,963 bp和153,870 bp,均包含两个反向重复区(IRs)、一个大单拷贝区(LSC)和一个小单拷贝(SSC)区四部分。薯蓣和叉蕊薯蓣均含有125个基因,其中包含87个蛋白编码基因,30个tRNA和8个rRNA。薯蓣和叉蕊薯蓣的GC含量分别为37.04%和37.17%,经比对发现薯蓣属叶绿体基因组中基因间隔区以及非编码区变异高于保守的蛋白编码区域,LSC区、SSC区变异明显大于IR区,筛选出了 10个适合作为潜在的薯蓣属植物鉴定的特异性DNA条形码序列,其中包括5个蛋白编码基因和5个基因间隔区。系统进化树分析显示叶绿体基因组也可作为鉴定薯蓣属物种的一个超级条形码,本研究为薯蓣属系统进化以及物种鉴定等领域的研究提供数据支持。
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