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背景:膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)是膜联蛋白家族成员,其异常表达与卵巢癌恶变、乳腺癌和结直肠癌耐药、转移及预后相关,本组前期研究表明ANXA11异常表达与鼠肝癌Hca-P细胞迁移、侵袭、耐药及淋巴道转移相关,本论文进一步研究ANXA11水平变化对人肝癌Bel7402细胞恶性行为、药物敏感性及其调控的分子机制。目的:1、将pGPU6/GFP/Neo-sh RNA-ANXA11表达载体稳转至Bel7402,筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株;2、探究ANXA11下调对Bel7402增殖、克隆形成、迁移、侵袭、细胞形态、黏附、细胞骨架及耐药性的影响;3、探究ANXA11调控Bel7402恶性行为的分子机制。方法:1、采用脂质体转染法将pGPU6/GFP/Neo-shANXA11表达载体转染至Bel7402,经G418筛选获得ANXA11稳定下调的单克隆细胞株,qRT-PCR和Western Blot方法检测ANXA11在细胞中水平变化;2、MTT法分析ANXA11下调对细胞增殖能力影响;3、平板克隆形成实验考察ANXA11下调对细胞克隆形成能力影响;4、结晶紫染色法观察ANXA11下调对细胞形态影响;5、Transwell小室法分析ANXA11下调对细胞迁移侵袭能力影响;6、FITC-Phalloidin标记丝状肌动蛋白F-actin比较ANXA11下调对细胞骨架影响;7、细胞黏附及淋巴结黏附实验分别分析ANXA11下调对细胞与细胞外基质黏附、细胞对淋巴结粘附能力影响;8、MTT结合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA11下调对细胞耐药性及抗药物诱导凋亡影响;9、q RT-PCR、Western Blot联合蛋白质组学方法寻找ANXA11调控Bel7402恶性行为相关联分子;10、在ANXA11稳定下调细胞株中瞬时转染siRNA-Cdc42,观察细胞转移能力恢复、定Cdc42在ANXA11调控Bel7402细胞转移能力中的作用。结果:1、获得ANXA11稳定下调的单克隆细胞株Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2,在m RNA水平分别降低73.0%(P=0.0016)、63.8%(P=0.0029),蛋白水平分别降低90.0%(P=0.0001)、88.0%(P=0.0003);2、较Bel7402-sh Ctrl,Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2增殖能力明显减弱;3、较Bel7402-sh Ctrl,Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2克隆形成能力降低57.4%和75.0%(P<0.0001);4、Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2较Bel7402-sh Ctrl迁移能力均上升2.3倍(P=0.0034、P=0.0015),侵袭能力分别上升3.4(P=0.0012)、3.3倍(P=0.0066);5、与Bel7402-sh Ctrl相比,Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2细胞变细长,丝状伪足明显增加,应力纤维蛋白表达量增加,外周致密带毛糙不规则;6、较Bel7402-sh Ctrl,Bel7402-shANXA11-1和Bel7402-shANXA11-2细胞与细胞外基质相对黏附率上升40.0%(P=0.0004)、43.0%(P=0.0004),与淋巴结黏附力升高4.5倍(P<0.0001)和6.4倍(P=0.0006),细胞伪足形成明显数量增多;7、ANXA11下调增强Bel7402对顺铂和5-FU耐药性;8、Erk通路在ANXA11下调Bel7402中受到抑制,MMP2、MMP9及Cdc42在Bel7402中水平随ANXA11下调升高;9、ANXA11下调引起Bel7402蛋白质组表达谱变化,其中Cdc42下游效应分子MRCK及Vinculin蛋白水平升高;10、在ANXA11稳定下调细胞株shANXA11-2中瞬转si RNA-Cdc42细胞黏附、迁移、侵袭能力均发生逆转,细胞骨架蛋白也由增强逆转为解聚。结论:1、获得了ANXA11稳定下调的单克隆Bel7402细胞株;2、ANXA11下调主要通过调控Erk通路抑制Bel7402细胞体外增殖及克隆形成能力;3、ANXA11表达水平与Bel7402细胞侵袭、迁移、细胞与细胞外基质(ECM)粘附及细胞与淋巴结粘附能力呈负相关,其表达水平降低能够显著增强上述生物学行为,主要通过调控Cdc42表达水平来增加Bel7402细胞丝状伪足形成进而增强Bel7402细胞恶性表型;4、ANXA11下调提高Bel7402细胞对顺铂和5-FU耐药性。