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目的脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智能发育障碍性疾病,是由于脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation gene 1,Fmr1)缺失或沉默,导致脆性X智能低下蛋白(Fragile X mental retardation protein,FMRP)表达较少或缺失引起的。脆性X智力低下基因型小鼠即Fmr1敲除(knockout,KO)小鼠在行为、认知和情感上表现出异于正常小鼠的特征。本实验采用脑立体定位技术和多导睡眠描记技术,通过光照的改变来探究光照对Fmr1 KO小鼠睡眠-觉醒的影响,旨在为FXS患者的诊断和治疗提供理论依据和实践参考。方法1实验动物雄性10周龄小鼠,SPF级,20~25 g,共24只。其中,Fmr1 KO C57BL/6J小鼠(n=11)由北京大学生命科学院生物膜与膜生物工程国家重点实验室张晨研究员提供;C57BL/6J小鼠(n=13)由安徽医科大学实验动物中心提供。按基因类型不同分为两组,Fmr1 KO C57BL/6J小鼠为实验组,C57BL/6J小鼠为对照组。2基因鉴定小鼠出生后两周左右,取尾部组织少许,进行PCR扩增,扩增产物经1%DNA琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。显影后与marker作比较,条带在~131 bp为野生型小鼠,条带在~400 bp为Fmr1 KO小鼠。选出需要的基因型雄鼠进行饲养。3动物手术小鼠经4%戊巴比妥钠行腹腔麻醉,麻醉剂量为0.04 ml/g。待小鼠痛觉反射消失后,将其固定于小鼠脑立体定位适配器上,依次埋置脑电和肌电电极,分别用于记录皮层脑电活动和颈背部的肌肉电活动。伤口处给予青霉素粉末并缝合伤口。待小鼠恢复清醒后放入恒温、恒湿、隔音和静电屏蔽功能的屏蔽箱内单独饲养一周,屏蔽箱内正常光照时间设置为:8:00 am~8:00 pm。4记录方法记录12 h:12 h明暗交替条件下的脑电图(electroencephalogram,EEG)和肌电图(electromyography,EMG);记录9:00 am~11:00 am期间开灯条件下的EEG和EMG;记录9:00 am~11:00 am期间撤光条件的EEG和EMG。小鼠的睡眠-觉醒情况包括:觉醒(wakefulness,W)、慢波睡眠(slow wave sleep,SWS)和快波睡眠(fast wave sleep,FWS)。5数据处理睡眠-觉醒数据以4 s进行分段,采用SPSS 20.0分析软件对组间试验数据进行ANOVA分析,两样本均数比较采用t检验,实验数据进行统计分析,实验结果以均数±标准差(`X±SD)表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。采用Graphpad Prism 5软件绘图。结果1小鼠基因鉴定手术前,采用PCR技术鉴定小鼠基因型,Fmr1 KO纯合子小鼠扩增出~400 bp的DNA片段,WT纯合子小鼠扩增出131 bp的DNA片段。选用Fmr1 KO雄鼠和WT雄鼠。2正常光照条件下WT和Fmr1 KO小鼠的睡眠-觉醒成一致的昼夜节律现象12 h:12 h明暗交替(8:00 am开灯和8:00 pm关灯)条件下的光照对Fmr1 KO(n=4)和WT小鼠(n=6)的总睡眠时间(total sleep time,TST)和觉醒时间的影响具有一致的昼夜节律变化,二者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。3撤光对9:00 am~11:00 am期间WT小鼠觉醒量的影响与正常12 h:12 h明暗(8:00 am开灯和8:00 pm关灯)交替的相同时段相比,WT小鼠(n=6)在撤光2 h(9:00 am~11:00 am)时的觉醒量发生明显变化,尤其是在撤光的第1小时(9:00 am~10:00 am)觉醒量显著增加(P<0.01)。具体表现为:撤光后的第一个阶段(9:00 am~9:20 am)小鼠的觉醒量增加了386.18%(P<0.01),撤光后的第二个阶段(9:20 am~9:40 am)增加了502.64%(P<0.01),撤光后的第三个阶段(9:40 am~10:00 am)增加了77.12%(P<0.01)。4撤光对9:00 am~11:00 am期间Fmr1 KO小鼠觉醒量的影响相比于WT小鼠相同时间段撤光前后的变化,撤光前后Fmr1 KO小鼠(n=6)觉醒量的增加幅度显著降低(P<0.01)。具体表现为:撤光后的第一个阶段(9:00am~9:20 am)小鼠的觉醒量增长了77.23%(P<0.05),撤光后的第二个阶段(9:20am~9:40 am)增长了205%(P<0.01),撤光后的第三个阶段(9:40 am~10:00am)增加了76.57%(P<0.01)。5撤光对9:00 am~11:00 am期间WT小鼠和Fmr1 KO小鼠TST变化率的影响与正常12 h:12 h明暗(8:00 am开灯和8:00 pm关灯)交替的相同时段相比,9:00 am~11:00 am期间撤光,WT小鼠和Fmr1 KO小鼠TST均降低。在撤光后的20 min(9:00 am~9:20 am)内Fmr1 KO小鼠的TST变化率显著低于WT小鼠的(P<0.01)。在其他时间段,撤光对WT小鼠和Fmr1 KO小鼠TST均有影响,但WT小鼠和Fmr1 KO小鼠之间相比较,TST变化率不具有统计学意义(P>0.05)。6撤光对9:00 am~11:00 am期间WT小鼠时相转换的影响在9:00 am~10:00 am期间撤光,WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W时相的转换次数依次由正常光照相同时段的5.14±0.51增加至28.86±1.77(P<0.01)、6.00±0.31增加至32.86±1.65(P<0.01)和0.86±0.26增加至4.00±0.44(P<0.01);与自身正常光照相同时段相比,在10:00 am~11:00 am期间撤光,WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W时相转换次数的变化较前一个小时明显减弱,但仍具有统计学差异(P<0.05)。7撤光对9:00 am~11:00 am期间Fmr1 KO小鼠时相转换的影响在9:00 am~10:00 am期间撤光,Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W时相的转换次数依次由5.29±0.36增加至15.71±0.57(t=-15.56,P<0.01)、6.29±0.42增加至24.71±0.68(P<0.01)和1.00±0.31增加至9.43±0.48(P<0.01);与自身正常光照相同时段相比,在10:00 am~11:00 am撤光期间,Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W时相的转换次数的变化不具有统计学意义(P>0.05)。8撤光对9:00 am~11:00 am期间WT小鼠和Fmr1 KO小鼠时相转换变化率的影响与正常12 h:12 h明暗(8:00 am开灯和8:00 pm关灯)交替的相同时段相比,9:00am~11:00 am期间撤光,WT小鼠和Fmr1 KO小鼠SWS-W、W-SWS和FWS-W时相转换数均增加。且在9:00 am~10:00 am期间撤光,WT小鼠和Fmr1 KO小鼠SWS-W、W-SWS和FWS-W时相转换数变化率之间的差异极显著(P<0.01)。在10:00 am~11:00 am期间撤光,Fmr1 KO小鼠的SWS-W时相转换数变化率显著低于WT小鼠的(P<0.05);Fmr1 KO小鼠的W-SWS、FWS-W时相转换数变化率于WT小鼠之间不具有统计学差异(P>0.05)。结论Fmr1 KO小鼠的睡眠-觉醒受光照改变的影响有所减弱。