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慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种以髓系前体克隆扩增为特征的恶性骨髓增生性肿瘤,是研究最广泛的肿瘤之一。CML的细胞遗传学特征是费城染色体(Ph),由t(9;22)(q34.1;q11.21)易位产生,包括位于9号染色体长臂上的Abelson白血病病毒(CABL)致癌基因和位于22号染色体长臂上的断点簇区域(BCR)重组导致融合基因的形成,即所谓的致癌基因BCR-ABL1。伊马替尼是首个用于CML治疗的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(TKI),因其高效和特定的作用机制而被广泛用于治疗CML。但随着广泛应用,副作用也随之出现,并且1/5的CML患者出现了耐药。因此,深入探讨其可能的发病机制,寻求新的治疗方法显得尤为迫切。已证实非编码RNA在肿瘤的发生发展中具有重要作用,作为非编码RNA中的一种,微小RNA(microRNA,miRNA)是广泛表达于原核和真核细胞内的一类小分子非编码RNA(22个核苷酸左右),通过与靶基因mRNA的3’untranslation region(3’-UTR)特异性相互作用来调控基因表达,参与机体多种病理生理过程(分化、增殖、生长、迁移、存活等),发挥重要作用。miR-141是miR-200家族成员之一,主要参与上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、增殖、迁移、侵袭、耐药等多种细胞过程。Edurne San等发现hsa-miR-141在耐药的CML患者中表达降低。课题组前期预实验中也发现miR-141-5p在初治CML患者和K562细胞株中显著低表达,在健康对照和CML患者治疗后表达上调,然而关于miR-141-5p在CML中生物学效应的认识仍不够深入。生物信息学软件预测miR-141-5p可靶向RAB32。RAB32是小型GTPases Ras超家族成员,调控多种细胞类型的细胞内膜转运事件。RAB32的高表达缩短了神经突长度,改变了线粒体形态,加速了人原代神经元和细胞系的凋亡/坏死。在CML中,miR-141-5p能否通过靶向RAB32对慢性粒细胞白血病细胞生物学产生影响,以及相关机制尚不清楚。本论文首次通过体内和体外实验观察miR-141-5p在CML中的表达和作用,并进一步探讨其可能的作用机制,为CML的诊断提供新的线索,为CML临床治疗寻找新的靶点。主要研究内容概括如下:1.MiR-141-3p和miR-141-5p在CML患者和CML K562细胞中的表达情况实验首先检测新诊断CML患者、健康人骨髓标本、K562、K562/G细胞和CD34~+细胞中miR-141-3p和miR-141-5p的表达情况。q-PCR证实miR-141-3p和5p在CML患者、K562和K562/G细胞中存在低表达现象,且miR-141-5p低表达更为显著。18例新诊断的CML患者接受TKI治疗后,通过回访发现,14例患者一年后BCR-ABL拷贝数明显下降,4例CML患者未出现显著下降。q-PCR再次检测miR-141-3p和5p在治疗后三个月CML患者中的表达水平,发现两者的表达水平较治疗前均有显著上调。提示低表达的miR-141可能在CML的发生、发展中发挥作用。2.MiR-141-5p在CML K562细胞株中的生物学效应鉴于miR-141-5p在CML患者中低表达更为显著,故进一步选取miR-141-5p作为研究对象,用阳离子脂质体法在K562细胞中分别转染miR-141-5p inhibitor&negative control和miR-141-5p mimics&negative control,下调或上调miR-141-5p的表达,Western blotting和q-PCR检测K562细胞中相关基因的表达情况,PI法染色后用流式细胞仪检测转染后细胞周期变化,Annexin V/PI法检测K562细胞株的凋亡情况。实验结果发现,转染miR-141-5p inhibitor后显著抑制了K562细胞中miR-141-5p的表达,同时K562细胞中c-Myc、Cyclin D1、MMP-3、MMP-9蛋白和mRNA表达水平显著增高,K562细胞的S期和G2/M期比例增高,提示miR-141-5p的低表达能够增强K562细胞的增殖、迁移能力;而转染miR-141-5p mimics后则显著上调K562细胞中miR-141-5p的表达,c-Myc、Cyclin D1、MMP-3、MMP-9蛋白和mRNA表达水平显著降低,cleaved caspase-3蛋白表达水平上调,S期和G2/M期的细胞比例降低,细胞凋亡比例显著增加,提示过表达miR-141-5p能显著抑制K562细胞的增殖、迁移能力,促进细胞的凋亡。3.MiR-141-5p对裸鼠成瘤能力的影响构建稳定表达miR-141-5p mimics negative control&mimics的K562细胞株,成功建成CML裸鼠移植瘤模型,观察并测量移植瘤的体积和重量。动物实验结果显示,与体内细胞的生长结果一致,miR-141-5p mimics组的肿瘤生长速度、体积和重量均明显低于对照组,提示miR-141-5p可能在CML中发挥抑癌基因的作用。4.MiR-141-5p靶向RAB32在CML中的机制研究MiRanda、Targetscan等软件预测,双荧光素酶报告基因法证实RAB32是miR-141-5p的直接靶基因。为探讨miR-141-5p靶向RAB32的作用机制,实验进一步研究了miR-141-5p对K562细胞RAB32表达的调控作用。Western blotting、q-PCR检测结果证实抑制或过表达miR-141-5p,RAB32蛋白和mRNA水平会出现相应的升高或降低。进一步分析miR-141-5p与RAB32表达水平在CML患者中的相关性,结果同样显示低表达miR-141-5p的CML患者中RAB32蛋白和mRNA呈现高水平;反之,高过表达miR-141-5p的健康对照和CML治疗后患者中RAB32蛋白和mRNA呈现相对低表达。提示miR-141-5p能够调控CML中RAB32的表达。使用RAB32 siRNA沉默RAB32表达后,能够抑制K562细胞的增殖、迁移能力,促进细胞凋亡。miR-141-5p mimics和空白质粒共转染进K562细胞,结果发现过表达miR-141-5p后,能够显著抑制K562细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡,而同时共转染RAB32过表达质粒(RAB32-N1)不能改变miR-141-5p mimics对K562细胞的增殖、迁移和凋亡的影响。提示miR-141-5p可能通过靶向RAB32在CML中发挥作用。