背景与研究目的：膀胱的主要功能是储存及排出尿液，作为下尿路重要的器官，膀胱功能异常所导致的下尿路症状，如尿频、尿急等发病率长期居高不下，并且随年龄的增长，发病率进一步提高，成为降低老年人生活质量的社会疾病。因此，膀胱功能异常疾病越来越受到人们的重视，但是目前科学家仍未能很好解释其中的发病原因，并找到解决的办法。在膀胱功能异常疾病中，最常见的是一类描述为尿频、尿急、急迫性尿失禁等排尿功能障碍症状为主的膀胱过度活动(overactive bladder，OAB)症候群。目前发现，慢性梗阻、炎症等诱因，导致的膀胱自身兴奋性异常，可能是OAB的重要病因。临床上采用的胆碱能受体阻滞剂，可以消除神经对膀胱的影响，在治疗中辅以肾上腺素能受体及钙离子通道阻断剂配合治疗，仍未能很好应对OAB的症状出现。因此，膀胱自身兴奋的异常，可能是部分OAB患者发病的真正原因，对于膀胱自身兴奋的研究已成为膀胱排尿功能障碍疾病中的研究热点。目前对膀胱的认识发现，膀胱虽然主要受副交感神经、交感神经系统的支配来完成尿液的储存及排出。但是很早就发现，膀胱具有类似胃肠道的离体自发性收缩功能，因此围绕膀胱的兴奋源头也各自发展了两种学说，即以WC de Groat为代表“神经源性学说”和以AF Brading为代表的“肌源性学说”。但是两者都存在无法解释对方现象的弊端，寻找新的兴奋起源成为了目前学术界研究的主要方向之一。尤其是对于肌源性学说来讲，膀胱的自发兴奋起源的研究长期未能得到实质性的突破，因此“肌源性”学说目前只是作为传统“神经源性”学说的重要补充，在膀胱兴奋性的调控中发挥自我调控的作用。直到2002年，英国科学家McCloskey在豚鼠膀胱中发现的一类与胃肠道起搏细胞ICC表面标志物c-kit染色阳性，及外形类似的特殊间质细胞-膀胱卡哈尔间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)。从而为“肌源性”学说注入了一阵兴奋剂，开启了肌源性学说新的篇章，关于膀胱ICC样细胞的研究也越来越多，并且在包括肾盂、输尿管、尿道、前列腺、阴茎等泌尿系统多个器官上都发现了c-kit染色阳性的细胞，被统称为泌尿系ICC样细胞，这些细胞在各自器官中的作用也逐渐得到展示。其中肾盂、尿道的ICC样细胞已被证实具有自发兴奋功能，在尿液的输出中发挥重要作用；而膀胱ICC样细胞虽然最早发现，但目前仍然对其生理及病理作用了解不深。尤其是该细胞能否作为膀胱的“起搏”细胞还存在争议。而自发兴奋的重要生理基础是细胞的跨膜离子流，其中钙离子是目前得到公认的传递兴奋的离子之一，不仅参与了信号的传导，更在膀胱平滑肌细胞收缩中发挥主要作用，已有充分的证据证明，在OAB等膀胱排尿功能障碍性疾病中，钙离子的失衡是其中的重要原因。因此以钙离子为研究对象，研究并阐述其在膀胱ICC样细胞中的作用，对解决目前的膀胱自发兴奋性的研究将起到重要作用。目前已知在诸如心肌等自发兴奋性的细胞膜上，存在大量钙离子通道，如L型、T型电压依赖型钙离子通道，它们是主要的钙离子内流通道，而钙离子的外排主要依赖一种成为钠钙交换体（NCX)的跨膜蛋白。NCX因其具有双向转运的特点，在心肌、神经元等多种细胞中发挥重要的稳定胞内钙离子平衡的作用。在已有的尿道ICC样细胞研究中显示，尿道ICC样细胞只表达NCX亚型3，并且NCX3的反向模式对尿道ICC样细胞的胞内钙离子升高，从而影响自发兴奋性具有重要作用。关于NCX在疾病中的研究也发现，它在诸如心衰、心律失常、缺血再灌注等疾病中发挥重要作用。因此排尿功能障碍性疾病钙离子而关于NCX在膀胱ICC样细胞中的作用还未见报道，因此我们推测，NCX可能也同样会影响膀胱ICC样细胞的胞内钙离子平衡，从而调控兴奋性。如果我们的假设成立，不仅丰富了钙离子对膀胱ICC样细胞兴奋调控的理论，同时为膀胱“肌源”性学说又增加了新的依据，并且为临床治疗排尿功能障碍性疾病提供了新的作用靶点。基于以上关于NCX在膀胱ICC样细胞兴奋调控的推论，本研究首先拟通过分子生物学和形态学方法对NCX及其亚型在膀胱中的表达进行观察。进一步通过功能学手段对NCX及其亚型参与膀胱ICC样细胞兴奋调控的作用及机制进行初步探索，最后对膀胱ICC样细胞上NCX的基本生理特性进行了初步研究。材料及方法：本研究采用2-3月龄大鼠作为主要研究对象，首先利用RT-PCR和Western blotting技术对正常大鼠膀胱组织中NCX1-3三个亚型的表达进行研究；然后通过免疫荧光技术阐述该通道三个亚型在膀胱中的具体分布情况；通过金属离子荧光探针负载技术观察培养的ICC样细胞，胞内钙离子浓度在NCX正向、反向模式中的变化，以及阻滞剂对ICC样细胞胞内钙离子的影响；另通过离体膀胱肌条实验，检测NCX正向、反向模式对肌肉收缩的影响，从而了解NCX在膀胱兴奋-收缩中的作用；最后利用膜片钳技术对急性分离的ICCs上的NCX电流进行检测，并记录特异性阻断剂下该电流的变化情况，对已记录的ICC样细胞进行单细胞PCR鉴定。结果：1. RT-PCR发现膀胱组织中NCX1-3三个亚型的mRNA均有表达，与大脑类似；WB检测发现膀胱组织中NCX1-3三个亚型的蛋白均有表达，利用灰度值进行半定量分析发现NCX1亚型表达比例最高，NCX2表达最低。2.激光共聚焦显微镜观察正常大鼠膀胱中NCX3阳性和c-kit阳性的细胞有共存现象，NCX1-2与myosin阳性的细胞有共存现象。3. NCX的正向模式可以降低膀胱ICC样细胞内的钙离子浓度，阻断剂KB-R7943在高浓度时（30μM）可减少钙离子的外流的速度，但无法阻止胞内钙离子的下降幅度；4. NCX的反向模式可以升高膀胱ICC样细胞内钙离子浓度；阻断剂KB-R7943在低浓度时（5μM）可降低胞内钙离子浓度升高速度，但幅度没有无统计学意义；5. NCX的正向模式可以导致离体平滑肌肌条收缩幅度的下降，及频率的增高，阻断剂KB-R7943在高浓度时（30μM）可进一步减小肌条的收缩幅度，但频率改变无统计学意义；6. NCX的反向模式可以导致离体平滑肌肌条收缩幅度的下降，及频率的增高，阻断剂KB-R7943在低浓度时（5μM）可进一步减小肌条的收缩幅度，但频率无明显改变；7.成功获得急性酶分离的大鼠膀胱ICC样细胞，并在该细胞上记录到典型的NCX电流轨迹，呈电压依赖性；8. KB-R7943作用后能显著降低该电流强度，说明上述电流是NCX电流，并且KB-R7943呈电压依赖和浓度依赖；9.单细胞PCR证实膜片钳测试后的细胞c-kit阳性，证实为ICC样细胞。结论：1.正常大鼠膀胱中NCX1-3均有表达，以NCX1为主；2.平滑肌细胞表达NCX1-2，膀胱ICC样细胞表达NCX3；3. NCX3与膀胱ICC样细胞的兴奋密切相关，NCX3的正向、反向模式能影响细胞内的钙离子浓度，阻断剂KB-R7943在不同浓度时的阻滞效果不同，可以延缓胞内钙离子的升高及下降速度，但无法改变幅度；4. NCX的正向、反向模式影响离体平滑肌肌条的兴奋-收缩，但是否通过ICC样细胞来调节还需要进一步实验；5. NCX3在膀胱ICC样细胞上通过典型的NCX电流，影响细胞的兴奋性。