白纹伊蚊唾液腺CTL1基因的表达与功能研究

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目的:C型凝集素(C-type lectins,CTLs)是一类钙依赖型糖结合蛋白超家族,它在先天免疫中作为模式识别受体发挥作用,也参与分子的相互作用。在长期的吸血进化过程中,蚊虫在唾液腺中形成了一系列有助于吸血生存的活性物质,这些物质能对脊椎动物具有抗凝血、抗炎和调节宿主免疫功能的作用,在促进蚊虫吸血与传病上具有重要意义。为了更深入的了解C型凝集素在白纹伊蚊唾液腺中的功能,我们对其克隆并原核表达重组蛋白,探讨其在在昆虫先天性免疫中的作用和蚊吸血过程中发挥的作用。  方法:用实时荧光定量RT-PCR构建不同组织表达谱。克隆Aalb_CTL1基因全长序列并进行生物信息学分析。进一步利用基因工程手段,将Aalb_CTL1插入到表达载体pET28a(+)中,构建Aalb_CTL1基因重组原核表达质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经纯化后用以免疫SD大鼠制备免疫血清。用Western Blotting方法初步分析纯化的重组蛋白的免疫学特性。用纯化后的重组蛋白进行了红细胞凝集活性,糖结合抑制凝集活性,抑菌活性及淋巴细胞增殖作用的功能初步探索。  结果:1.通过构建不同组织的表达谱发现,Aalb_CTL1特异的高表达于雌蚊唾液腺中。2.成功克隆得到Aalb_CTL1基因,全长462bp,编码153个氨基酸。Aalb_CTL1基因含有一个19个氨基酸的信号肽,InterPro Scan分析表明其含有一个CRD结构域。PCR、双酶切及测序结果均表明重组质粒 pET28a(+)-Aalb_CTL1构建成功。经SDS-PAGE进行检测分析,发现 Aalb_CTL1基因的表达产物出现了明显的特异性条带,其融合表达产物的大小与预测的一致,利用分步透析进行了蛋白的复性,进一步用Ni-NTA亲和层析柱将重组蛋白纯化,获得了高含量高纯度的目的蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,说明成功获得Aalb_CTL1多克隆抗体。3.通过细胞凝集活力测定证实Aalb_CTL1具有凝集素最基本的功能——红细胞凝集活性,而这种凝集活性必须依赖钙离子的存在;Aalb_CTL1重组蛋白对兔、小鼠及大鼠等脊椎动物红细胞均有凝集活性。而这种凝集活性可被 D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、蔗糖和麦芽糖所抑制;对甘露糖的结合能力大于其他糖类的结合能力。4.通过微量液体稀释法测重组Aalb_CTL1的半数抑制浓度(IC50),发现其对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用,IC50为22.5μg/ml。5.本研究用 ConA作为刺激剂,观察了 Aalb_CTL1对离体小鼠脾细胞的作用。  结果显示Aalb_CTL1在25-100μg/ml时对离体小鼠脾细胞增殖具有明显的抑制作用。然而,随着 Aalb_CTL1浓度的降低,其抑制作用逐渐降低,到了较低浓度时,发现 Aalb_CTL1对离体小鼠脾细胞具有促进增殖的作用,这种增殖作用显著高于ConA的增殖作用。结论 Aalb_CTL1是一种典型的钙离子依赖的C型凝集素,在体外可抑制离体脾细胞增殖作用。
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