研究目的NLRP3(Nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3)炎症小体是研究最多也最深入的炎症小体,由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和前体半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(pro-caspase-1)组成。由NLRP3炎症小体所导致的炎症反应失调,与多种人类疾病密切相关,这些疾病包括自身炎症综合征、心血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等。因此,NLRP3炎症小体活动的精确调控可能为治疗多种炎症性疾病提供潜在靶标。蛋白翻译后修饰对NLRP3炎症小体的活化有重要的调控效应,而NLRP3炎症小体的乙酰化与去乙酰化调控机制尚未阐明。组蛋白去乙酰化酶10(Histone deacetylase 10,HDAC10)作为组蛋白去乙酰化酶家族成员之一,对NLRP3炎症小体激活的作用机制仍不清楚。本课题研究了 HDAC10对于NLRP3炎症小体活化的调控效应与作用机制。这对于阐明NLRP3相关性疾病的发生发展以及根据其机制探究免疫调节治疗的新途径有重要的临床意义。材料和方法1.NLRP3的乙酰化检测1.1检测组蛋白乙酰转移酶对NLRP3的乙酰化效应在HEK293T细胞系中过表达NLRP3、CBP、P300和Tip60后,应用蛋白印迹(Western Blot)方法,检测细胞内源性的CBP、P300和Tip60对于NLRP3的乙酰化效应。并应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)方法,检测细胞外源性CBP、P300和Tip60对于NLRP3 的乙酰化效应。1.2检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对NLRP3乙酰化的调控效应在HEK293T细胞系中转染NLRP3表达载体,加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA),另设单加TSA的溶剂甲醇的细胞作为对照组。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法,检测TSA对于NLRP3乙酰化的调控效应。2.HDAC10对NLRP3的作用效应检测2.1与NLRP3发生结合效应的HDAC家族成员的筛选应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中分别转染NLRP3、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC8、HDAC10 表达载体和空白载体。转染质粒24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP方法筛选出与NLRP3发生结合的HDAC家族成员分子。2.2检测HDAC10与NLRP3的结合情况在筛选出HDAC10与NLRP3结合的基础上,应用Co-IP和Western Blot方法进一步验证HDAC10与NLRP3的结合情况。2.3构建HDAC10和NLRP3各结构域缺失的截短突变体应用 KOD-Plus-Mutagenesis 试剂盒分别构建 NLRP3(△ PYD、△NACHT、△LRR)和HDACI0(△DAC、△LRD)各结构域缺失的截短突变体,以及NLRP3各个结构域的表达载体(1-93aa、220-536aa、742-991aa)。2.4检测介导NLRP3与HDAC10结合的NLRP3蛋白结构域应用脂质体Lipofectamine2000在HEK293T细胞系中共转染HDAC10与NLRP3或其结构域缺失的截短突变体(△PYD、△NACHT、△LRR)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测HDAC10与NLRP3的各截短突变体的结合情况。2.5检测介导NLRP3与HDAC10结合的NLRP3结构域表达载体应用脂质体Lipofectaminc2000在HEK293T细胞系中共转染HDAC10与NLRP3或其各结构域表达载体(1-93aa、220-536aa、742-991aa)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测HDAC10与NLRP3各结构域表达载体的结合情况。2.6检测介导HDAC10与NLRP3结合的HDAC10蛋白结构域应用脂质体Lipofectamine2000在HEK293T细胞系中共转染NLRP3与HDAC10或其结构域缺失的截短突变体(△DAC、△LRD)以及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测NLRP3与HDAC10各截短突变体的结合情况。2.7在疾病模型中探究HDAC10的生理意义小鼠腹腔源性巨噬细胞被LPS和ATP刺激后,诱导NLRP3炎症小体的激活。Western Blot检测NLRP3、HDAC10、剪切型caspase-1、剪切型IL-1β的蛋白水平。同时,在GEO数据库中,搜索与NLRP3炎症小体活化相关的动物模型。使用Oligopackage评估微阵列质量。然后用RMA来预处理原始数据。对数据集(GSE52004)进行差异基因分析和GSEA分析,以观察HDAC10在NLRP3炎症小体活化的动物模型中的表达情况。2.8 HDAC10对NLRP3的调控效应2.8.1 HDAC10对NLRP3的调控效应检测在HEK293T细胞系中分别转染不同浓度的HDAC10表达载体及空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Western Blot和NLRP3抗体检测不同浓度的HDAC10对于NLRP3的蛋白表达影响。2.8.2 HDAC10对NLRP3发挥调控效应的结构域检测应用脂质体Lipofectamine2000在HEK293T细胞系中共转染NLRP3与HDAC10或其结构域缺失的截短突变体(△ DAC、△ LRD)。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。Western Blot检测NLRP3的蛋白水平。2.8.3放线菌酮(Cycloheximide,CHX)实验检测HDAC10对NLRP3的调控效应应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中分别转染NLRP3、HDAC10的表达载体或空白载体。转染质粒24h后,加入CHX,作用不同时间点(Oh、4h、8h、12h),裂解细胞,收集蛋白。Western Blot方法检测CHX作用不同时间点的NLRP3的蛋白水平。2.8.4蛋白酶体抑制剂或自噬抑制剂检测HDAC10对NLRP3的调控效应应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中共转染NLRP3、HDAC10的表达载体或空白载体。转染质粒24h后,用蛋白酶体抑制剂MG 132或自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)处理细胞,作用4h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Western Blot检测NLRP3的蛋白表达水平。3.HDAC10对NLRP3炎症小体活化的调控效应3.1 HDAC10对腹腔源性巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的调控效应应用转染试剂Interferin向腹腔源性巨噬细胞中转染Si-HDAC10,以Si-NC转染的细胞作为对照组。转染48h后,应用LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切型、IL-1 β及其剪切型的蛋白水平。收集腹腔源性巨噬细胞上清后,应用ELISA的方法检测IL-1 β的分泌水平。转染Si-HDAC10后,用LPS刺激细胞2h,裂解细胞,收集并提取细胞总RNA。应用 qRT-PCR 检测NLRP3、ASC、CASP1、IL-1β的mRNA 水平。并同时检测非特异性炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平。3.2 HDAC10对骨髓源性巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的调控效应应用转染试剂Interferin向骨髓源性巨噬细胞中转染Si-HDAC1O,以Si-NC转染的细胞作为对照组。转染48h后,应用LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切型、IL-1 β及其剪切型的蛋白表达水平。收集骨髓源性巨噬细胞上清后,应用ELISA的方法检测IL-1β的分泌水平。转染Si-HDAC10后,用LPS刺激细胞2h,裂解细胞,收集并提取细胞总RNA。应用qRT-PCR检测NLRP3、ASC、CASP1、IL-1β的mRNA水平。并同时检测非特异性炎症因子TWF-α、IL-6的mRNA水平。3.3 TSA对腹腔源性巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的调控效应TSA处理腹腔源性巨噬细胞,另设TSA的溶剂甲醇处理的细胞作为对照组。处理细胞48h后,LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切型、IL-1 β及其剪切型的蛋白水平。收集腹腔源性巨噬细胞上清后,应用ELISA的方法检测IL-1 β的分泌水平。TSA处理细胞48h后,用LPS刺激细胞2h,裂解细胞,收集并提取细胞总RNA。应用 qRT-PCR 检测NLRP3、ASC、CASP1、IL-1β的 mRNA 水平。并同时检测非特异性炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平。3.4 TSA对骨髓源性巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的调控效应应用TSA处理骨髓源性巨噬细胞,另设TSA的溶剂甲醇处理的细胞作为对照组。处理细胞48h后,应用LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切型、IL-1 β及其剪切型的蛋白水平。收集骨髓源性巨噬细胞上清后,应用ELISA的方法检测IL-1 β的分泌水平。TSA处理细胞48h后,用LPS刺激细胞2h,裂解细胞,收集并提取细胞总RNA。应用qRT-PCR检测NLRP3、ASC、CASP1、IL-1β的mRNA水平。并同时检测非特异性炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平。4.HDAC10对NLRP3炎症小体活化的调控机制4.1 HDAC10对NLRP3的去乙酰化检测应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中分别转染NLRP3、Tip60表达载体、不同浓度的HDAC10表达载体或空白载体。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。应用Co-IP和Western Blot方法检测NLRP3的乙酰化水平。4.2 腹腔源性巨噬细胞验证HDAC10对NLRP3去乙酰化效应应用转染试剂Interferin向腹腔源性巨噬细胞中转染Si-HDAC10,以Si-NC转染的细胞作为对照组。转染48h后,LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。应用Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切型、IL-1β及其剪切型的蛋白水平、NLRP3的乙酰化水平。4.3 HDAC10对NLRP3的泛素化水平的影响应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中共转染NLRP3、泛素(Ub)表达载体和HDAC10表达载体,以空白载体转染的细胞作为对照组。转染24h后,裂解细胞,收集蛋白。泛素化实验检测HDAC10对NLRP3泛素化水平的影响。4.4验证乙酰化对NLRP3的泛素化效应的影响应用脂质体Lipofectamine2000向HEK293T细胞系中分别转染NLRP3和Ub表达载体,并加入TSA处理细胞,另设TSA的溶剂甲醇处理的细胞作为对照组。泛素化实验检测NLRP3的泛素化水平,Co-IP实验检测NLRP3的乙酰化水平。4.5腹腔源性巨噬细胞验证HDAC10对NLRP3的泛素化效应的影响应用转染试剂Interferin向腹腔源性巨噬细胞中转染Si-HDAC10,以Si-NC转染的细胞作为对照组。转染48h后,LPS刺激细胞6h,并于收集细胞蛋白前30min加入ATP刺激细胞。裂解细胞,收集蛋白。泛素化实验检测NLRP3的泛素化水平。研究结果1.NLRP3能发生乙酰化修饰1.1组蛋白乙酰转移酶能够诱导NLRP3发生乙酰化修饰Western Blot检测结果显示,与对照组相比,分别过表达CBP、P300、Tip60后,细胞内源性NLRP3的乙酰化水平显著增强。Co-IP检测的结果表明,与对照组相比,分别过表达CBP、P300、Tip60后,细胞外源性NLRP3的乙酰化水平显著增强。以上实验结果显示,NLRP3能够在组蛋白乙酰转移酶(CBP、P300、Tip60)的作用下发生乙酰化,提示NLRP3能发生乙酰化修饰。1.2 TSA能够增强NLRP3的乙酰化水平Western Blot实验结果表明,与对照组相比,加入TSA后细胞内源性NLRP3的乙酰化水平显著增强。Co-IP和Western Blot的实验结果表明,与对照组相比,加入TSA后细胞外源性NLRP3的乙酰化水平显著增强。以上实验结果显示,TSA抑制了组蛋白去乙酰化酶的效应后,NLRP3的乙酰化水平显著上调。这一结果提示,NLRP3可能是通过组蛋白去乙酰化酶的去乙酰化效应对其乙酰化水平进行负向调控。2.HDAC10 负向调控 NLRP32.1 HDAC10 与 NLRP3 结合Co-IP结果显示,在HEK293T细胞中HDAC10能与NLRP3发生结合。2.2 NLRP3的NACHT结构域介导NLRP3与HDAC10的结合Co-IP和Western Blot结果显示,NACHT结构域缺失后,NLRP3不能与HDAC10结合。220-536aa结构域即NACHT结构域能够与HDAC10结合。进一步说明,NACHT结构域是NLRP3与HDAC10结合的结构基础,提示NLRP3与HDAC10的结合效应。2.3 HDAC10的DAC结构域介导HDAC10与NLRP3的结合Co-IP和Western Blot结果显示,HDAC10的DAC结构域缺失后,HDAC10不能与NLRP3发生结合。该结果表明DAC结构域是HDAC10与NLRP3结合的结构基础,进一步提示HDAC10与NLRP3发生结合效应。2.4激活NLRP3炎症小体时HDAC10的表达显著下调Western Blot结果显示,激活NLRP3炎症小体时,HDAC10的蛋白表达显著下调。在急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)模型中,NLRP3炎症小体活化时,HDAC10的表达显著下调。经过GESA分析发现,HDAC10参与免疫应答和炎症反应,对赖氨酸代谢与调节、乙酰转移酶复合物的调节有一定作用。2.5 HDAC10抑制NLRP3的蛋白水平2.5.1 HDAC10抑制NLRP3的表达,且呈剂量依赖性Western Blot结果表明,HDAC10过表达后,NLRP3的蛋白水平显著下调,且呈剂量依赖性。这一结果显示,HDAC10能抑制NLRP3的蛋白表达,且呈一定的剂量依赖性。2.5.2 LRD结构域介导HDAC10对NLRP3的负向调控效应Western Blot结果显示,当HDAC10的LRD结构域缺失后,NLRP3的蛋白水平下调被逆转。而当HDAC10的LRD结构域过表达后,NLRP3的蛋白水平显著下调。这一结果提示,HDAC10通过其LRD蛋白结构域负向调控NLRP3的表达。2.5.3 HDAC10显著性降低NLRP3的蛋白德定性CHX实验结果显示,阻断蛋白从头合成后,随着时间增加,HDAC10能够显著下调细胞中NLRP3的蛋白水平。这一结果进一步提示,HDAC10能促进NLRP3的降解,降低其蛋白稳定性,进而对NLRP3的蛋白表达水平发挥显著的负向调控效应。2.5.4 HDAC10通过蛋白酶体途径促进NLRP3蛋白的降解Western Blot检测结果显示,HDAC10介导的NLRP3蛋白降解效应,可以被MG132逆转,但不能被氯喹逆转。这些结果提示,HDAC10通过蛋白酶体途径而非溶酶体途径介导NLRP3的降解,进而负向调控NLRP3。3.HDAC10负向调控NLRP3炎症小体的活化3.1.1在HDAC10表达受抑制的腹腔源性巨噬细胞中,NLRP3炎症小体的活化显著增强Western Blot检测结果显示,HDAC10受抑制后NLRP3、剪切型caspase-1、剪切型IL-1 β的蛋白水平显著升高,上清中IL-1 β的分泌水平显著上调。qRT-PCR结果显示,HDAC10被抑制不会影响NLRP3、1L-1β的mRNA水平。HDAC10被抑制也不会影响非特异性炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平。上述结果表明,在腹腔源性巨噬细胞中,HDAC10能够在蛋白水平上负向调控NLRP3炎症小体的活化,但对其mRNA表达无显著影响。且HDAC10对TNF-α、IL-6等非特异性炎症因子的mRNA表达也无调控效应。这一结果提示,HDAC10是通过调控NLRP3蛋白水平而非mRNA水平,进而抑制NLRP3炎症小体的激活。3.1.2在HDAC10表达受抑制的骨髓源性巨噬细胞中,NLRP3炎症小体的活化显著增强Western Blot 和 ELISA 结果显示,HDAC10被抑制后,NLRP3、剪切型 caspase-1、剪切型IL-1 β的蛋白水平显著升高。上述结果表明,在骨髓源性巨噬细胞中,HDAC10能够在蛋白水平上发挥对NLRP3炎症小体激活的负向调控效应。3.2.1经TSA处理的腹腔源性巨噬细胞的NLRP3炎症小体的活化显著增强Western Blot实验结果显示,经TSA处理后,NLRP3、剪切型caspase-1、剪切型IL-1 β的水平显著上调。上述结果进一步证实,在腹腔源性巨噬细胞中,HDAC10能够在蛋白水平上负向调控NLRP3炎症小体的活化。3.2.2经TSA处理的骨髓源性巨噬细胞的NLRP3炎症小体的活化显著增强Western Blot结果显示,经TSA处理后,NLRP3、剪切型caspase-1、剪切型IL-1β的水平显著上调。上述结果进一步证实,在骨髓源性巨噬细胞中,HDAC10能够在蛋白水平上发挥对NLRP3炎症小体激活的负向调控效应。4.HDAC10能显著降低NLRP3的乙酰化水平Co-IP结果显示,HDAC10过表达后,NLRP3的乙酰化水平显著下调。这一研究结果提示,HDAC10能抑制NLRP3的乙酰化水平,对NLRP3发挥去乙酰化效应。5.HDAC10通过其去乙酰化抑制NLRP3炎症小体的激活Western Blot结果显示,HDAC10被抑制后,NLRP3、剪切型caspase-1、剪切型IL-1 β的水平显著上调,NLRP3的乙酰化水平也显著上调。结果提示,HDAC10通过其去乙酰化抑制NLRP3炎症小体的激活。6.HDAC10促进NLRP3的蛋白泛素化修饰泛素化实验结果显示,HDAC10过表达后,NLRP3的蛋白泛素化水平显著上调。这一结果提示,HDAC10促进NLRP3的泛素化,进而对NLRP3进行负向调控。7.乙酰化能抑制NLRP3的泛素化效应结果显示,经TSA处理后,NLRP3的乙酰化水平显著上调,其蛋白泛素化水平显著下调。这一结果提示,乙酰化能抑制NLRP3的泛素化水平。8.HDAC10通过其去乙酰化作用提高NLRP3蛋白的泛素化水平泛素化实验结果显示,HDAC10受抑制后,NLRP3的蛋白泛素化水平显著降低。以上结果提示,HDAC10对NLRP3的泛素化水平起一定的正向调控效应,通过对NLRP3的去乙酰化作用促进其泛素化降解,进而负向调控NLRP3。结论1.组蛋白乙酰转移酶(CBP、p300、Tip60)或TSA能增强NLRP3的乙酰化效应。2.我们首次证实了Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶HDAC10能够与NLRP3发生结合,且HDAC10能通过对NLRP3的去乙酰化效应负向调控NLRP3的蛋白水平。3.我们首次证实HDAC10能够通过抑制NLRP3的蛋白表达,进而负向调控NLRP3炎症小体的活化。创新性及研究意义1.本课题首次发现组蛋白乙酰转移酶(CBP、P300、Tip60)和TSA能诱导NLRP3的乙酰化修饰,而HDAC10能与NLRP3结合,对其发挥去乙酰化调控。2.本课题首次证实HDAC10通过负向调控NLRP3的蛋白水平,进一步抑制NLRP3炎症小体的活化。为NLRP3炎症小体相关的疾病提供了一个潜在的治疗靶标,具有一定的学术价值和临床意义。