研究背景由于癌症发病率和死亡率的持续增高,目前仍然是世界上重要的公共卫生问题。从2010年开始,癌症在中国已成为主要的致死原因。根据中国癌症中心2016年报道,在分析了国内2009-2011年72个始终可用的登记中心数据后,对2015年新发病例及死亡数进行估计,预计有4292000个新发癌症病例和2814000个癌症死亡病例,其中肺癌的发病率和死亡率最高,总发病率为733300人,其中男性为509300人,占恶性肿瘤第一位,女性为224000人,仅次于乳腺癌发病率;总死亡率为610200人,其中男性为432400人,女性为177800人,死亡率均为第一位。近年来,肺癌发病率最高的病理类型已由肺鳞癌向肺腺癌转变,肺腺癌成为肺癌中发病率最高的类型,约占非小细胞肺癌的一半,而非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%。肺腺癌易复发及远处转移,预后相对鳞癌差。目前,肺腺癌的治疗方案是以外科手术为主的综合治疗,化疗为其中的综合治疗方法之一。肺癌的化疗以联合用药为主,铂类为联合用药的基础药物之一。顺铂(cisplatin,DDP)是最常用于肺癌化疗的一线铂类药物,在肺癌的综合治疗中具有重要作用。虽然肺腺癌对化疗比较敏感,但由于各种原因导致部分患者产生耐药,从而降低了化疗效果,致使病情进展,出现复发或远处转移。DDP为铂的金属络合物,其靶点为DNA,作用在链间与链内交链,形成DDP-DNA复合物,从而干扰DNA的复制,属周期非特异性细胞毒药物。目前铂类药物主要耐药机制包括:增强了药物的失活、减少了细胞内药物积累、增强DNA修复能力、间接调控因子变化等,涉及多种基因和信号转导通路。然而肺腺癌的耐顺铂机制复杂,目前尚未完全阐明。因此进一步研究顺铂的肺腺癌耐药机制,改善化疗的敏感性,提高化疗效果,对延长耐药患者的生存时间具有重要意义。半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)是β半乳糖凝集素家族成员之一,在多种组织中分布,与较多生理过程有关。Gal-1由位于22q12染色体的LGALS1基因编码,其中对Gal-1表达的调节机制中包括启动子的甲基化状态。Gal-1过表达与细胞转化、粘附、增殖、血管生成以及侵袭等方面有关,对肿瘤的进展和预后具有较大影响。Gal-1的高表达与多种恶性肿瘤有关,例如鼻咽癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌等。有研究显示,Gal-1的表达与宫颈癌的分期、浸润和淋巴结转移呈正相关。目前国内外在肿瘤耐药方面筛选基因或蛋白时发现Gal-1可能与部分肿瘤耐顺铂有关。由此说明,Gal-1参与多种恶性肿瘤的发生发展,深入研究Gal-1在恶性肿瘤中的作用对于临床上诊治恶性肿瘤具有重要意义。目前国内外尚未见对耐顺铂肺腺癌中Gal-1进行体内外研究的报道,本课题重点研究探索Gal-1在肺腺癌耐顺铂中的潜在机制。RNA干扰(RNAinterference,RNAi),由Fire等在1998年首次发现并给予命名,作为在2002年度美国科学界最重要的科技成果之一。在随后的几年中,在RNAi方面的研究发展迅速,取得了很多重要研究成果:2001年在哺乳动物的细胞培养中,应用RNAi技术进行抑制基因的表达被首次报道,创新性的应用该技术在高等生物基因功能中进行研究;2002年RNAi技术用于哺乳动物的实验研究;2004年RNAi技术用酶法构建全基因组短干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)文库新技术,并对动物基因功能进行了高通量RNAi研究等。肿瘤多药耐药的发生是多基因、多因素参与的过程,而RNAi成为了研究肿瘤多药耐药的新策略。本课题设计采用RNA干扰技术特异性沉默Gal-1,观察Gal-1被干扰后对顺铂的敏感性实验,研究Gal-1对耐顺铂A549(A549/DDP)细胞生物学特性的影响。用A549细胞系、A549/DDP细胞系及沉默Gal-1的细胞系接种裸鼠成瘤,进行顺铂的敏感性实验;通过体内、外实验验证Gal-1对A549/DDP细胞系耐药的影响。同时选择临床中肺腺癌手术患者,对其组织进行Gal-1的检测,并收集临床相关数据,进行统计学分析。通过体内、外实验及临床相关性研究,进一步了解Gal-1在肺腺癌顺铂耐药中的机制,为针对逆转肺腺癌顺铂耐药进行研发药物提供实验依据。第一部分Galectin-1在人肺腺癌A549及A549/DDP细胞中表达情况目的通过检测Gal-1在人肺腺癌A549及A549/DDP细胞中的表达情况,探讨Gal-1对人肺腺癌A549/DDP细胞系耐顺铂的影响。方法1.人肺腺癌A549及A549/DDP细胞常规进行复苏、培养、传代及冻存;2.将两组细胞接种于96孔板培养,按梯度加入顺铂,共分为10个浓度梯度,分别为(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,12.8,25.6)μg/ml,每个梯度设为5个复孔,应用CCK8法测定两组细胞OD值,然后通过半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)及耐药指数验证 A549/DDP细胞的耐药性;3.应用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测两组细胞中Gal-1在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果1.A549 细胞的 IC50 值为:2.16±0.30μg/ml;A549/DDP 细胞的 IC50 值为:17.66±1.21μg/ml,耐药指数为 8.18(P<0.05)。2.与A549细胞相比较,Gal-1 mRNA的表达水平在A549/DDP细胞中显著升高(0.76±0.03vs.0.39±0.01;P<0.05)。3.与A549细胞相比较,Gal-1蛋白表达水平在A549/DDP细胞中显著升高(0.85 ±0.03 vs.0.61 ±0.02;P<0.05)。结论1.人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性稳定,耐药指数为8.18。2.Gal-1可能是A549/DDP细胞系耐顺铂的一个潜在基因,可作为候选耐药蛋白进一步研究。第二部分 沉默Galectin-1对A549/DDP细胞逆转作用的体内外实验研究目的通过沉默Gal-1在人肺腺癌A549/DDP细胞中的表达,在体内外实验中逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,探讨Gal-1影响A549/DDP细胞耐顺铂的作用,为进一步研究其耐药机制和药物研发提供实验依据。方法1.应用慢病毒稳定转染法沉默人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞中的Gal-1,将细胞进行培养传代。2.应用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测A549、A549/DDP细胞和对照组 A549/C、A549/DDP/C 细胞及沉默 Gal-1 的 A549(A549/I)、A549/DDP(A549/DDP/I)细胞中Gal-1 mRNA和蛋白的表达。3.应用CCK8法测定OD值,计算各组细胞的IC50,计算A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的耐药指数。4.通过在裸鼠腋下注射 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞建立裸鼠肿瘤模型,在成功构建成瘤模型的裸鼠中,每组随机选取5只裸鼠进行实验。腹腔内注射顺铂,观察肿瘤在模型体内的生长,4周后处死裸鼠,测量肿瘤重量及直径。5.应用免疫组织化学和Western blot两种方法分别检测A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组裸鼠肿瘤中 Gal-1 的表达。结果1.Gal-1 mRNA 在 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞中表达量分别为:0.38±0.01、0.39±0.03、0.22±0.02、0.76±0.02、0.75±0.05、0.23±0.03。在A549/DDP细胞中的Gal-1 mRNA表达高于在A549中的表达(P<0.05);A549/I、A549/DDP/I细胞组间Gal-1 mRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05),均低于在A549中的表达(P<0.05)。2.Gal-1 蛋白在 A549、A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞中表达量分别为:0.61±0.02、0.59±0.03、0.28±0.02、0.85±0.03、0.84±0.01、0.31±0.04。在A549/DDP细胞中的Gal-1蛋白表达高于在A549中的表达(P<0.05);A549/I、A549/DDP/I细胞组间Gal-1蛋白的表达比较无统计学意义(P>0.05),均低于在A549中的表达(P<0.05)。3.A549 细胞的 IC50 值为 2.16±0.30μg/ml;A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的 IC50 值分别为 2.17±0.31、1.88±0.27、17.66±1.21、17.48±1.02、2.97±0.18μg/ml;A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的耐药指数为 1.00、0.87、8.18、8.09、1.38;A549/DDP、A549/DDP/C细胞组IC50值及耐药指数大于A549细胞组(P<0.05);A549、A549/C、A549/I、A549/DDP/I 细胞组间 IC50 值及耐药指数比较无统计学意义(P>0.05)。4.裸鼠成瘤实验过程中无死亡。A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组肿瘤体积分别为:761.19±52.13、763.16±51.04、725.84±67.46、1554.61±123.35、1523.58±98.66、804.98±61.63mm3;A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组肿瘤重量分别为:0.35±0.02、0.35±0.02、0.34±0.02、0.70±0.02、0.71±0.03、0.37±0.03g;A549/DDP 组瘤重及体积大于 A549、A549/I、A549/DDP/I 组(P<0.05);A549 与 A549/I、A549/DDP/I组比较瘤重及体积无统计学意义(P>0.05)。5.在裸鼠肿瘤中,免疫组化与Western blot法检测结果表明,Gal-1在A549/I、A549/DDP/I 组的表达明显低于 A549/DDP 组(P<0.05);而在 A549、A549/DDP组中分别与A549/C和A549/DDP/C组相比较无统计学意义(P>0.05)。结论1.慢病毒稳定转染法沉默Gal-1能够在人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞中稳定传代。2.人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞均能够成功构建裸鼠成瘤模型。3.沉默Gal-1能够提高A549/DDP细胞在体内外实验中对顺铂的敏感性。4.体内外实验进一步验证了 Gal-1在A549/DDP细胞耐顺铂中产生影响,为进一步研究其耐药机制和药物研发提供实验依据。第三部分Galectin-1、ERCC1在肺腺癌组织中的表达及临床意义目的研究人肺腺癌组织中Gal-1、切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementary gene 1,ERCC1)在肺腺癌组织中的表达及临床意义。方法1.收集2011年11月到2012年12月蚌埠医学院第一附属医院胸外科经术后病理证实的肺腺癌手术患者91例。所有患者均为术后应用含顺铂为基础的辅助化疗方案。采用免疫组化法测定术后石蜡包埋的肺腺癌组织中Gal-1、ERCC1的表达情况。2.分析Gal-1与ERCC1的相关性;Gal-1、ERCC1与患者的年龄、性别、吸烟及临床分期的相关性;3.通过对患者的随访,将两种指标对预后的影响进行分析,探讨与预后的关系。结果1.Gal-1在肺腺癌中的阳性表达率为30.77%(28/91);ERCC1在肺腺癌中的阳性表达率为31.87%(29/91)。Gal-1、ERCC1在肺腺癌中同时阳性表达18例,同时阴性表达52例。McNemar配对资料χ2检验的结果,P=1.00(P>0.05),提示Gal-1、ERCC1在肺腺癌中的表达无显著性差异。而根据临床诊断一致性 Kappa 检验,Kappa=0.46,P=0.00(P<0.05),说明 Gal-1、ERCC1 在肺腺癌中的表达具有一致性。2.肺腺癌组织中Gal-1的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、TNM分期等临床指标无相关性(P>0.05)。3.肺腺癌组织中ERCC1的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、TNM分期等临床指标无相关性(P>0.05)。4.Gal-1 阳性表达组中位无瘤生存期(disease-free survival,DFS)为(19±1.96)个月,而阴性表达组为(27±1.62)个月,差异具有统计学意义(χ2=22.48,P=0.00)。Gal-1 阳性表达组中位总生存时间(overall survival,OS)为(22±1.02)个月,而阴性表达组为(33±1.56)个月,差异具有统计学意义(χ2=36.81,P=0.00)。5.ERCC1阳性表达组中位DFS为(21±1.30)个月,而阴性表达组为(27±1.53)个月,差异具有统计学意义(χ2=7.03,P=0.01)。ERCC1阳性表达组中位OS为(25±1.04)个月,而阴性表达组为(33±1.72)个月,差异具有统计学意义(χ2=11.64,P=0.00)。6.Gal-1、ERCC1同时阳性表达组中位DFS为(18±2.83)个月,而阴性表达组为(29±1.40)个月,差异具有统计学意义(χ2=12.13,P=0.00)。Gal-1、ERCC1同时阳性表达组中位OS为(22±1.00)个月,而阴性表达组为(35±1.77)个月,差异具有统计学意义(χ2=21.30,P=0.00)。结论1.Gal-1与ERCC1在肺腺癌中的表达具有一致性。2.Gal-1、ERCC1与肺腺癌患者的性别、年龄、吸烟、TNM分期等临床指标无相关性。3.Gal-1、ERCC1与肺腺癌的术后辅助化疗的预后有关,可作为判断预后的指标,同时检测具有更好的准确性。