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目的:应用分子生物学的技术,探讨微囊藻毒素对体外培养的肝细胞的损伤机制,并且对抗氧化营养素及B族维生素对微囊藻毒素染毒所致肝细胞的损伤的保护作用进行研究,为寻找肝脏保护与肝癌预防的有效方法提供参考。方法:1、购买BRL(大鼠肝细胞)细胞株,待增殖情况稳定,开始试验。2、MC-LR染毒肝细胞,24小时后MTT法检测细胞增殖情况。3、应用流式细胞仪检测毒素对细胞凋亡情况的影响。4、根据正交设计结果,BRL预先加入维生素作用,24小时后加入MC-LR染毒,检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSHPX)。5、RT-PCR:结合正交设计实验,筛选出有效的保护组合,通过逆转录PCR技术,测定目的基因PCNA和UDG在mRNA水平上的改变。结果:1、与正常组细胞相比,MC-LR在浓度低于1μg/ml时,促进BRL增殖,浓度为0.5μg/ml时,细胞增长达到峰值;MC-LR浓度高于1.25μg/ml时,抑制细胞增殖。2、MC-LR染毒BRL后,细胞凋亡发生变化,当浓度在0.001～0.5μg/ml范围,凋亡率逐渐增加,1～2.5μg/ml凋亡率逐渐减少。3、与正常组细胞相比,不同浓度MC-LR作用下,PCNA表达量及UDG表达量差异有统计学意义。当MC-LR浓度在0.01～1.0μg/ml范围内,PCNA表达量随MC-LR浓度的增加而增加,在MC-LR浓度达到1.25μg/ml时,PCNA表达量开始下降;UDG表达的变化趋势与PCNA一致。4、正交分析结果显示:与没有维生素保护的染毒细胞相比,VitB6、VitB12、VC作用后,细胞内SOD、GSH-PX含量增加,差异有统计学意义,并且VitB12与VC存在协同效应。5、在高浓度MC-LR干预下,与没有维生素保护的染毒细胞相比,维生素B6、B12+VC作用后,PCNA表达量升高,差异有统计学意义。B6、B12、B12+VC作用后,UDG表达量增加,差异有统计学意义。在低浓度MC-LR干预下,与没有维生素保护的染毒细胞相比,维生素B6、B12作用后,PCNA表达量增加,差异有统计学意义; B6、VC、B12、B12+VC作用后,UDG表达量减少,差异有统计学意义。结论:1、MC-LR在不同浓度时对肝细胞增殖和凋亡的作用是不同的,在低浓度时有促进细胞增生的作用,凋亡率逐渐增加;在高浓度时却表现为抑制细胞生长或细胞毒作用的表现,凋亡率逐渐降低。2、MC-LR通过影响BRL的PCNA和UDG基因mRNA表达,启动BER修复途径,可能是BRL氧化损伤后的修复机制之一。3.维生素VitB6、FA、VitB12、VC对MC-LR致BRL损伤有保护作用,其中,维生素一阶交互作用的最佳保护组合为:VitB12+ VC。