背景与目的:膜性肾病（membranous nephropathy,MN）是常见的自身免疫性肾小球肾炎,以上皮下的免疫复合物沉积为主要特征。近年来,MN在我国等发展中国家的发病率呈逐年上升趋势。尽管有三分之一左右的MN患者可自发缓解,但仍有约40%的患者可在十年内进展为终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）,严重影响患者的生存质量。目前MN的诊断主要依靠有创的肾组织活检技术,用于MN治疗的药物以类固醇、烷化剂、钙调神经磷酸酶抑制剂及利妥昔单抗为主,尚无特异的治疗方法。因此,寻求有效的诊断标志物及特异性治疗靶标是MN研究中亟需解决的问题。基因组学分析被视为系统生物学研究的里程碑,是鉴定生物标志物和阐明疾病病理机制的有效方法。其中芯片检测及分析已经应用于研究人类的多种肾脏疾病,如肾细胞癌、糖尿病肾病、急性肾损伤和肾移植排斥等。Hauser等人对实验性膜性肾病基因芯片的研究揭示了肾脏细胞的DNA损伤和修复,以及细胞外间质的变化是疾病的主要病理过程。然而,MN的发病机制及相关的分子生物学原因仍不完全明确。本文应用人类全基因组表达谱芯片技术对MN患者与健康人肾皮质的基因进行差异表达分析和富集分析,拟探索在MN中异常表达的基因及其相关的生物学过程和代谢通路;并进一步探索显著影响这些过程或通路的核心基因,以期了解MN的潜在分子机制,为MN的诊疗提供新的思路。方法:1.研究对象:本研究共纳入14例原发性膜性肾病（idiopathic MN,i MN）患者,其中包含i MNⅠ-Ⅱ期患者（MNⅠ-Ⅱ组）7人,i MNⅢ期患者（MNⅢ组）7人。所有患者均经肾穿刺病理活检确诊为i MN,并根据组织形态学及免疫荧光表达分为MNⅠ-Ⅱ及MNⅢ两组。肾皮质活检组织均取自患者初次治疗之前。另有正常对照者（HC组）7人。2.全基因组表达谱芯片杂交:每组收集3例肾皮质活检组织,应用Mini BEST Universal RNA Extraction试剂盒分别提取各样本的总RNA。应用Illumina全基因组表达谱芯片分别对各样本的总RNA进行芯片杂交实验。分析MNⅠ-Ⅱ组vs HC组及MNⅢvs HC组的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,对MNⅠ-Ⅱ组vs HC组的DEGs和MNⅢ组vs HC组的DEGs取交集,以获得在两个比较组中均差异表达的基因,即共同差异表达基因（overlapping differentially expressed genes,ODEGs）。3.生物信息学分析:利用GO（Gene Ontology）数据库对ODEGs进行生物学功能（Biological process,BP）富集分析,利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库对ODEGs行通路富集分析,进一步筛选核心基因,并对全部核心基因进行文献检索分析。4.血脂浓度测定:采集MNⅠ-Ⅱ组、MNⅢ组患者及HC组空腹静脉血,应用GPO-PAP法检测血清甘油三酯（TG）水平,应用CHOD-PAP法检测血清总胆固醇（TCHOL）浓度,应用直接法-过氧化氢酶清除法检测血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLc）及低密度脂蛋白胆固醇（LDLc）的浓度。进一步分析血清TG、TCHOL、HDLc及LDLc与核心基因的m RNA信号强度的相关性。5.RT-PCR验证:为进一步验证表达谱芯片数据,收集MNⅠ-Ⅱ组、MNⅢ组及HC组各4例肾皮质活检组织,利用RT-PCR测定PLA2G12B在各样本的m RNA水平,以ACTB为内参,采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。6.免疫荧光染色:为验证关键基因PLA2G12B编码蛋白在MN患者肾皮质中表达的变化,对MNⅠ-Ⅱ组、MNⅢ组及HC组的全部肾皮质活检石蜡标本进行切片,利用免疫荧光染色评估PLA2G12B蛋白在各组肾皮质中的表达量。7.PLA2G12B蛋白体外刺激足细胞:为探讨PLA2G12B蛋白对人足细胞的作用,体外培养人足细胞,以PLA2G12B蛋白按照时间梯度予以刺激,分为对照组（0h）、0.5h、1h、2h及6h组,分别以流式细胞仪检测足细胞的凋亡情况,以高效液相色谱-质谱法检测培养基中的花生四烯酸水平。8.统计学分析:应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。组间差异分析应用Welch’s t检验。相关性分析应用Pearson秩相关性检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.MNⅠ-Ⅱ组与HC组比较,有291个上调基因及659个下调基因;MNⅢ组与HC组比较,上调及下调的基因数分别为217及382个。在MNⅠ-Ⅱ组vs HC组与MNⅢ组vs HC组的共同差异表达基因中,上调者为167个,下调者为291个。2.通过GO BP富集分析,发现上调的ODEGs主要富集在甘油三酯代谢、丙氨酸分解代谢及乙醛酸分解代谢等代谢相关过程,而下调的ODEGs主要富集在白细胞活化、白细胞细胞间粘附及白细胞趋化作用等炎症反应相关过程。3.进一步对ODEGs行KEGG通路富集分析,结果显示上调的ODEGs参与16个KEGG通路,包括胆固醇代谢、脂肪的消化及吸收、花生四烯酸代谢等。下调的ODEGs参与13个信号通路,包括细胞-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路及NF-κB信号通路等。4.从上述GO BP及KEGG通路富集项中共筛选出38个核心基因,包括PLA2G12B（phospholipase A2 groupⅫ）、APOA1（apolipoprotein A1）、APOB（apolipoprotein B）、APOC3（apolipoprotein C3）及CETP（cholesteryl ester transfer protein）等与脂质代谢相关的基因。5.MN患者肾皮质中的PLA2G12B、CD8A（CD8a molecule）、LTB（lymphotoxin beta）及NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）等m RNA信号强度与患者血脂参数相关。6.RT-PCR检测显示PLA2G12B的m RNA水平在MN患者肾皮质中较正常对照组增加,与芯片结果一致。7.免疫荧光检测结果显示在MNⅠ-Ⅱ组与MNⅢ组中PLA2G12B的表达均较在HC组中显著升高,而在MNⅠ-Ⅱ组与MNⅢ组间并无统计学差异。8.PLA2G12B体外刺激足细胞,发现0.5h组细胞凋亡与对照组无显著差异,1h、2h及6h组细胞凋亡的百分比均较对照组有显著增加,且随作用时间的增加,凋亡细胞百分比呈递增趋势。9.花生四烯酸浓度检测结果显示,0.5h组及1h组的花生四烯酸浓度与对照组之间无显著差异,而2h组及6h组的浓度均较对照组有显著升高。结论:1.脂质代谢相关代谢通路,包括胆固醇代谢及花生四烯酸代谢等在MN的致病机制中具有重要作用。2.免疫反应相关代谢通路,包括IL-17信号通路及NF-κB信号通路等可能是MN致病机制中的重要代谢通路。3.PLA2G12B可在体外诱导人足细胞凋亡。4.PLA2G12B可能通过花生四烯酸代谢导致MN中足细胞的损伤。