【摘 要】
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吡咯并吲哚生物碱是一大类重要的活性天然产物,约占天然生物碱总数的1%,其中C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱普遍具有优良的生理活性。相比于数量庞大的同源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱,目前报道的异源二聚化的该类生物碱数量仅有5个,并且缺乏统一、高效的构建和拓展该类分子骨架的方法,严重限制了对该家族化合物的药学和生物学研究。因此,在本论文中,我们通过四部分的研究对异源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生
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吡咯并吲哚生物碱是一大类重要的活性天然产物,约占天然生物碱总数的1%,其中C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱普遍具有优良的生理活性。相比于数量庞大的同源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱,目前报道的异源二聚化的该类生物碱数量仅有5个,并且缺乏统一、高效的构建和拓展该类分子骨架的方法,严重限制了对该家族化合物的药学和生物学研究。因此,在本论文中,我们通过四部分的研究对异源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱（Naseseazines A/B/C）的生物合成、结构拓展及生物活性进行了深入探究,具体内容如下:1)Naseseazines C及其类似物的高效生物合成:首先通过解析Naseseazines C的生物合成途径,成功确定了关键的P450酶—Nasc B;随后利用顺磁共振、TEMPO抑制实验以及DFT计算等方法解析出Nasc B高效的催化机制,即:自由基介导的高度区域/立体选择性的分子内环化和分子间加成反应。通过将Nasc B构建到新型抗溶菌大肠杆菌GB05dir-T7中,开发出一套高效的全细胞催化体系;通过喂养化学合成的30个环二肽底物,成功得到30个结构新颖的异源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱;最后,经生物活性检测我们发现其中有些化合物具有神经保护功能,特别是化合物NAS-12,NAS-27,NAS-10,NAS-11展示出了比阳性对照药—尼莫地平更好的效果。2)Naseseazines A/B及其类似物的高效生物合成:首先利用异源表达、化学合成标品等方法确定负责合成Naseseazines A/B的关键P450酶—Nasb B;随后利用体外试验证实其催化合成Naseseazines A/B的活性;通过分枝杆菌系统,我们开发出另一套高效的全细胞催化体系;通过喂养化学合成的30个环二肽底物,成功得到了10个新结构;另外,利用同源建模及分子对接方法在Nasb B蛋白上找出调控合成Naseseazines B和Naseseazines C的关键位点,即V165和F361;最后通过生物活性检测我们发现NAS-37具有较好的神经保护功能。3)基因组挖掘法增加Naseseazine类化合物结构多样性:首先以Nasc B为探针酶在NCBI数据库中找出与其同源性较高的P450酶,并从中筛选出附近有CDPS或者NRPS基因的P450酶入选为可能会催化生成异源二聚化的C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱的目标P450酶;随后通过进化树分析确定出其它8个蛋白,即SA-P450,AO-P450,S1868-P450,F5053-P450,SAC-P4501,SAC-P4502,41663-P450,STDA-P450;之后利用大肠杆菌或者分枝杆菌表达系统对这8个目标蛋白进行表达纯化,经一系列体外生化实验及全细胞催化实验对其中部分P450酶的底物谱进行了初步筛选,目前成功发现了另外15个二聚产物,其相应结构目前正在解析中。4)酶工程改造法增加Naseseazine类化合物结构多样性:F5053-P450催化c WL-PL可以同时产生Nasc B以及S1868-P450的催化产物;通过采用嵌段置换以及单点突变的方法我们成功发现68,89,287,291位点处的氨基酸残基对这些蛋白的催化反应的区域/立体选择性具有关键调控作用,在Nasc B中将该4个位点同时突变为S1868中的位点后S1868-P450产物变为主要产物;对这四个位点分别进行饱和突变得到76个突变体,将其全部构建到全细胞催化体系中后,以cWL-PL为底物进行活性分析以期发现新的具有不同区域/立体选择性的结构骨架,目前分析工作正在进行中。经过以上四部分的研究,我们成功发现了一系列具有催化产生异源二聚化C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱的P450蛋白,同时开发了两种简单高效的全细胞催化体系,通过初步筛选化学合成的30种环二肽底物,目前我们已经发现了55种新颖的二聚化产物;此外,我们还结合基因组挖掘和酶工程改造方法找出四个（68,89,287,291）对反应区域/立体选择性具有关键调控作用的氨基酸位点,通过对这四个位点进行饱和突变以期进一步发现具有不同区域/立体选择性的异源二聚化的结构骨架。
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