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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前严重危害人类生命健康的疾病之一,肝细胞癌的磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)对比剂几乎采用非肝癌细胞靶向对比剂,对肿瘤早期确诊仍存在较大困难。本项目在前期肝细胞靶向研究基础上,进一步研发针对肝癌细胞具有特异靶向能力的双源性MRI对比剂。本项目的研究结果提升了 HCC的早期诊断率,实现HCC分子水平的早期特异性诊断。首先,以EDC为交联偶合剂,利用硬脂酸上的羧基与两端氨基化的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)的一端氨基进行酰胺反应,将硬脂酸(Stearic Acid,SA)与PEG共价偶联上,合成SA-PEG-NH2嫁接物。然后,利用PEG上的氨基与A54多肽上的羧基进行酰胺反应,将A54多肽偶联至PEG上,成功合成A54-PEG-SA。采用单硬脂酸甘油酯为脂质材料,以水性溶剂扩散法制备对肝脏具有肝脏被动靶向功能的磁性纳米结构脂质载体(SPIO-loaded nanostructured lipid carrier,SNLC)和具有外源性肝癌细胞特异主动靶向功能的磁性纳米结构脂质载体(A54modefied SNLC,A54-SNLC)。对SNLC和A54-SNLC两种磁性纳米结构脂质载体的理化性质进行评价。粒径、电位及多分散指数测定结果显示,本研究所制备的两种磁性纳米结构脂质载体的粒径分别为46.4±3.44 nm和45.8±3.96 nm,表面电位为-20.9±1.05 mV 和-21.5±1.13 mV。透射电子显微图片(Transmission Eelectron Microscope,TEM)显示所制备的两种磁性纳米结构载体为粒径分布均一,呈类球形,内部可见Fe3O4纳米颗粒,图片结果与粒径电位测定仪测定的结果基本一致。构建对肝癌细胞具有内源性特异铁蛋白表达作用的含有AFP启动子的AFP-Fth质粒(DNA);以鱼精蛋白(Protamine)为复合材料,通过正负电荷相互作用结合磁性纳米结构脂质载体和铁蛋白基因质粒,制备具有肝癌细胞特异靶向的双源性MRI对比剂,即A54-SNLC/鱼精蛋白/DNA三元复合物(A54-SNPD)。室温条件下,连续2周粒径监测结果显示所制备的三元复合物粒径分布均一,无聚集现象,表明本研究所制备的A54-SNPD三元复合物具有较好的分散性及稳定性。采用TEM进一步观察三元复合物的形态结构及粒径分布情况,其结果与粒径仪测定结果一致。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法考察磁性纳米结构脂质载体和不同质量比的A54-SNPD三元复合物纳米粒的细胞毒性,研究结果表明纳米载体和三元复合物纳米粒在肿瘤细胞和正常细胞上均具有较低的细胞毒性。体外细胞转染实验结果表明A54-SNLC/鱼精蛋白/DNA的质量比为20/4/1时,基因转染效果最好,初步确定三元复合物A54-SNPD的最佳质量比例为20/4/1。采用Western Blot分析Bel-7402细胞和LO2细胞的AFP表达情况,得出LO2细胞中基本无AFP蛋白表达,而Bel-7402细胞中有AFP蛋白表达。进一步分析经质量比为20/4/1的A54-SNPD三元复合物转染Bel-7402和LO2细胞前以及转染48 h后的铁蛋白表达水平,结果表明在AFP启动子控制下,经过A54-SNPD(20/4/1)转染的Bel-7402细胞中的铁蛋白表达水平明显高于未经转染的Bel-7402细胞中的铁蛋白表达水平,相比之下,A54-SNPD转染的LO2细胞和未转染的LO2细胞之间的铁蛋白表达水平并无显著差异。报告基因质粒AFP-Fth在AFP阳性的Bel-7402细胞中的铁蛋白表达水平高于在AFP阴性的LO2细胞的铁蛋白表达水平,研究结果表明A54-SNPD中的报告基因在Bel-7402细胞上具有特异性铁蛋白表达能力。分别采用荧光倒置显微镜和流式细胞仪考察不同时间点下不同细胞对A54-SNPD的靶向性摄取能力,发现与SNPD相比,Bel-7402细胞可在3h和6h显著提高对A54-SNPD的摄取能力,而加入游离A54多肽后,Bel-7402细胞对A54-SNPD的摄取能力降低;而LO2细胞对A54-SNPD和SNPD的摄取能力无显著性差异,证实了 Bel-7402细胞对A54-SNPD的外源性靶向摄取能力。成功构建裸鼠皮下移植瘤模型和原位移植肝癌模型,并通过组织病理学评价肿瘤模型的构建。组织病理学结果发现,Bel-7402肿瘤组织免疫组化呈AFP阳性染色。与此相反,正常肝组织免疫组化呈AFP阴性染色,这一结果进一步表明Bel-7402肿瘤为AFP阳性肿瘤,与上述细胞结果一致。左右两侧分别接种荷HepG2和Bel-7402肿瘤的裸鼠通过小动物荧光活体成像仪体内分布研究结果表明,A54-SNLC能够特异地到达并蓄积在Bel-7402肿瘤部位,而对HepG2肿瘤无特异性的靶向作用。小动物荧光活体成像仪对A54-SNPD和SNPD在裸鼠原位移植肝癌模型的在体靶向性摄取研究结果亦表明,A54-SNPD能够通过A54多肽介导的主动靶向作用机制使得荷Bel-7402小鼠的肝癌组织对其的靶向摄取能力强于SNPD,结果提示A54-SNLC及A54-SNPD对Bel-7402肿瘤均表现出了较强的靶向能力。磁性纳米结构脂质载体A54-SNLC和SNLC的样品MRI扫描结果表明,本研究所制备的磁性纳米结构脂质载体A54-SNLC具有负性造影效果,并存在一定的浓度效应关系,即在一定浓度范围之内,随着A54-SNLC浓度的增加,其T2WI负性强化效果越明显,A54-SNLC可作为磁共振T2对比剂;磁性纳米结构脂质载体体外细胞MR成像结果表明,A54-SNLC被Bel-7402细胞摄取后,其信号强度降低最明显,表明A54-SNLC对Bel-7402细胞具有外源性靶向能力;体内MR成像研究显示,当A54-SNLC和SNLC被注入裸鼠体内后,A54-SNLC组肿瘤的信号强度值降低程度明显高于SNLC组,表明A54-SNLC对Bel-7402肿瘤具有外源性靶向能力。三元复合物纳米粒(A54-SNPD,A54-SNP,SNPD,SNP)体内MR分子成像研究显示,A54-SNPD三元复合物具有明显的负性强化效果,通过A54-SNPD纳米颗粒的T2对比增强,能成功降低肝肿瘤的T2信号强度,且其靶向效果从6h开始能持续到48h,A54-SNPD组相对于其它三组能使肿瘤的SNR值降低最明显,结果表明A54-SNPD三元复合物纳米粒对B el-7402肿瘤组织同时有外源性靶向作用的铁蓄积和内源性特异性的铁蛋白表达,具有双源性MR成像作用。因此,A54-SNPD三元复合物纳米粒作为肝癌靶向T2 MRI对比剂,能够显著提高肝癌的诊断敏感性和特异性。总结以上实验,本研究成功制备了对肝癌细胞及肿瘤具有特异性靶向功能的双源性三元复合物纳米粒(A54-SNPD),并通过体内外实验证实A54-SNPD在肝癌靶向磁共振分子成像中具有良好的应用前景。