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昆虫蜕皮变态是受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)所调控的。在幼虫向蛹蜕皮变态时,20E启动并调控了包括Broad-Complex(BR-C),E74,E75和βFTZ-F1等早期转录因子的表达,这些早期表达的基因进一步激活其它与蜕皮变态直接相关的效应基因,如蛹期特异性表达的翅原基表皮蛋白基因(Bombyx mori wing dics cuticle proteins,BmWCPs)。目前发现蛹期特异性表达的翅原基表皮蛋白有11个,分别为BmWCP1-11。本研究以家蚕中此类蛹期特异性表达的蛋白为研究对象,开展了生物信息学分析、表达、功能以及相关调控机理的研究。结果表明: (1)用家蚕基因组序列进行系统的生物信息学分析表明:11个家蚕BmWCPs呈簇分布在基因组中,除BmWCP6和BmWCT10分别分布在7号和21号染色体上外,其余的BmWCPs均分布在22号染色体上,并且成串分布。这11个BmWCPs的核苷酸长度为588-2670bp,编码115-312个氨基酸,蛋白分子量为12-35kDa,等电点为4.30-7.45。 (2)基因结构分析表明:11个家蚕BmWCPs都在开放阅读框(ORF)内有内含子的插入,其中BmWCP6只有一个内含子,BmWCP7有4个内含子;BmWCP1、BmWCP2、BmWCP3、BmWCP9和BmWCP11各有2个内含子,而BmWCP4、BmWCP5、BmWCP8和BmWCP10则各有3个内含子的插入。11个BmWCPs内含子长度范围在80-5958bp之间,平均长度为1121bp。其中分布频率最高的是在50-300bp之间,占了46%。 (3)利用11个家蚕BmWCPs启动子序列,对这些启动子可能含有的调控元件预测分析表明,BmWCPs都具有与蜕皮激素信号传导途径相关的转录因子相结合的可能元件,但这些调控元件的数目,位置以及核心碱基外的序列,不同的BmWCPs是不一样的。在这11个BmWCPs的上游调控区共发现33个BRC-Z1,33个BRC-Z2,28个BRC-Z4,23个E74A,141个POU,21个FTZ,5个USP潜在的反应元件。其中,POU元件核心碱基85.83%为ATTA,BRC-Z1元件核心碱基82.86%为ACAA,BRC-Z2元件核心碱基94.44%为AATAa/AATAg,BRC-Z4元件核心碱基90.63%为TAAAnnnaa(n为任意碱基,n处碱基含一个A有18.75%,含两个A有56.25%,含三个A有25.00%)。 (4)家蚕BmWCPs基因大致有两种表达模式,一是仅在化蛹时大量表达,一是在化蛹时和蛹中期大量表达。其中,BmWCP4的表达至少受两个核转录因子BmBRC和BmPOUM2的直接或间接调控。RT-PCR分析表明,这两个转录因子在化蛹期和蛹中期强烈表达,与第二类BmWCPs的表达时期一致。并且,用20E处理5龄第4天的幼虫或是用20E处理体外培养的翅原基实验表明,核转录因子BmBRC-Zs(BmBRC-Z1,BmBRC-Z2和BmBRC-Z4)、BmPOUM2-L以及BmWCPs均受到20E诱导表达,其中9个BmWCPs(BmWCP1,BmWCP2,BmWCP3,BmWCP4,BmWCP5,BmWCP6,BmWCP7,BmWCP8和BmWCP9)的表达需要一个20E的脉冲峰,18小时左右才会表达,而BmWCP10和BmWCP11则不需要这个脉冲峰,20E可直接诱导其表达增强。 (5)BmBRC-Zs,BmPOUM2及BmWCPs三者之间的具体表达模式,利用PCR技术扩增得到11个BmWCPs的启动子,在细胞中分别超表达BmBRC-Z1,BmBRC-Z2,BmBRC-Z4和BmPOUM2-L,对这11个BmWCPs的启动子活性分析表明:ⅰ)当BmPOUM2-L在细胞中超表达时,BmWCP4、BmWCP5、BmWCP6、BmWCP7和BmWCP8的启动子活性明显增强,说明该基因对这5个基因的表达起到正调控的作用。ⅱ)当BmBRC-Zs超表达时,在9个BmWCPs中,BmWCP5、BmWCP7和BmWCP8都可以受到BmBRC-Z2和BmBRC-Z4的调节;BmWCP3的表达在BmBRC-Z1和BmBRC-Z4调节下增强;BmBRC-Z1和BmBRC-Z2表达使BmWCP11的启动子活性增强;而BmWCP1、BmWCP4和BmWCP10分别受到BmBRC-Z1、BmBRC-Z4和BmBRC-Z2的调控。ⅲ)当BmBRC-Zs和BmPOUM2-L共同超表达时,与这两种转录因子分别超表达时相比,很有可能BmBRC-Z1调控了BmWCP1、BmWCP3和BmWCP11的表达,而BmPOUM2-L没有参与;BmBRC-Z2和BmPOUM2-L很有可能共同调节了BmWCP5、BmWCP6、BmWCP7和BmWCP8的表达;BmBRC-Z4和BmPOUM2-L很有可能共同调节了BmWCP4、BmWCP5、BmWCP6、BmWCP7和BmWCP8的表达。 BmBRC-Zs和BmPOUM2-L一起调控BmWCP4、BmWCP5、BmWCP6、BmWCP7和BmWCP8的表达,而仅BmBRC-Zs直接或间接参与BmWCP1、BmWCP3、BmWCP10和BmWCP11的表达,这种精确的表达调控模式为家蚕从幼虫到蛹过程中,翅原基表皮精确形成和发育提供保证。