研究背景和目的卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,虽经过规范化的治疗,包括理想的肿瘤细胞减灭术和以铂类和/或紫杉醇为基础的联合化疗,晚期卵巢癌的5年生存率仍徘徊在15%—20%左右,对化疗药物产生耐药性是造成卵巢癌5年生存率得不到改善的一个重要原因。化疗耐药可分为原发性和继发性两种。约有15%—20%的卵巢癌患者对顺铂等化疗药物原发耐药。多数患者在接受化疗的过程中逐渐产生耐药性,临床表现规范化疗停药6个月内临床复发、用药期间出现部分缓解、最好的疗效为稳定等。肿瘤的耐药现象一方面与抗肿瘤药物的反复作用引起基因的突变或后遗传性改变有关,另一方面也有赖于肿瘤中已经存在的耐药细胞亚群的选择性生长。铂类的耐药机制尚未明确,主要涉及以下几个方面:1、药物在肿瘤细胞内蓄积减少,包括细胞对药物的摄入减少和主动外排增加;2、肿瘤细胞对抗肿瘤药物的转化和解毒功能增强;3、肿瘤细胞内DNA修复功能增强;4、铂类药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中,细胞凋亡传导通路上的调节蛋白的表达改变等。作为目前临床治疗卵巢癌的一线化疗药物,阐明其耐药机制,对逆转临床耐药和提高患者5年生存率具有重要的意义。2003年,本课题组受北京协和医院重点基金资助,开展了卵巢癌耐药相关蛋白的比较蛋白质组分析、寻找耐药相关候选蛋白的研究。在通过体外诱导构建卵巢癌SKOV3顺铂耐药细胞株,以及获购卵巢癌顺铂敏感(A2780)、耐药细胞株(A2780/CDDP)的基础上,采用双向电泳技术(2-DE)比较卵巢癌顺铂敏感、耐药细胞的蛋白质表达图谱,鉴定差异表达蛋白,筛选获得目标耐药候选蛋白AnnexinA3。利用基因工程技术,构建含正义、反义Annexin A3序列的真核表达质粒,人为地上调或下调Annexin A3蛋白的表达水平,验证了Annexin A3蛋白与铂类耐药的相关性,进而又从动物水平和人体水平进一步探讨其在体内发挥耐药功能的可能性。近期研究表明,细胞耐药现象可能与抗癌药物引起的细胞凋亡程序缺陷有关。顺铂能够诱导肿瘤细胞凋亡,控制细胞凋亡途径有关的信号传导通路、调节蛋白的异常表达可能与细胞的药物敏感性相关。本研究在前期工作的基础上,首先检测了卵巢癌耐药细胞系在体外稳定培养过程中耐药性的维持及Annexin A3蛋白的表达。采用基因工程技术,构建含正义和反义Annexin A3序列的逆转录病毒载体,转染卵巢癌细胞系。进一步验证AnnexinA3在顺铂诱导细胞凋亡通路中的可能作用机制。研究内容及方法1、体外常规培养卵巢癌顺铂敏感细胞系SKOV3、A2780,以及耐药细胞系SKOV3/CDDP、A2780/CDDP,采用MTT的方法检测细胞的耐药指数,并从不同时间复苏和持续培养两个不同角度探讨耐药细胞系耐药性的维持。比较两细胞系细胞形态(姬姆萨—瑞氏染色)、生长曲线(7天培养法)、生长周期(流式细胞仪检测)等生物学特性的差异。Western blot鉴定两细胞系Annexin A3蛋白表达的差异。2、分别构建含正义、反义Annexin A3序列的逆转录病毒载体,通过PCR、双酶切、测序后基因比对鉴定重组载体。感染包装细胞PT67,转染NIH 3T3细胞测定病毒滴度。转染相应的肿瘤细胞,筛选阳性克隆,Western blot鉴定细胞转染后Annexin A3表达水平的变化。扩增转染后经筛选鉴定的阳性克隆,MTT法比较转染前后细胞的耐药性。比较转染前后细胞的形态(姬姆萨—瑞氏染色)、生长曲线(7天培养法)、生长周期(流式细胞仪检测)等生物学特性的差异。3、顺铂作用24小时后,采用流式细胞仪分别检测卵巢癌化疗敏感、耐药、以及转染正义、反义Annexin A3的细胞凋亡率。以不同浓度的顺铂作用24小时,Western blot观察凋亡途径上的作用蛋白Caspase 3、Caspase 9、Caspase 8及Survivin表达水平的差异。研究结果1、采用MTT法前后间隔5个月、分别三次测定卵巢癌耐药细胞的耐药指数。SKOV3/CDDP的耐药指数分别为1.84±0.37、2.18±0.19、2.07±0.57,A2780/CDDP的耐药指数分别为2.95±0.26、3.24±0.56、2.96±0.58,RI的差异无统计学意义(P＞0.05)。耐药细胞持续培养,在0week、2weeks、4weeks、6weeks、8weeks时间点检测细胞耐药指数,差异无统计学意义(P＞0.05)。姬姆萨—瑞氏染色结果显示:SKOV3/CDDP细胞多核及畸形核多见,A2780/CDDP部分细胞呈梭形,细胞核改变不明显。耐药细胞的群体倍增时间延长。耐药细胞的细胞周期中,G0-G1期细胞比例增加,S、M期细胞比例减少,差异有统计学意义(P＜0.05)。耐药细胞AnnexinA3表达水平增高。2、以正义、反义Annexin A3质粒为模板,行PCR增加XhoⅠ酶切位点,琼脂糖凝胶电泳可见1kb左右预期条带。重组病毒载体鉴定:以菌液为模板行PCR、EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切重组载体,琼脂糖凝胶电泳可见预期条带;用通用引物双向测序,序列拼接后与GenBank内anx3基因cDNA比较,序列100%相符。pMSCV-sense anx3病毒滴度平均值=1.55×10~5CFU/mL,pMSCV-antisense anx3病毒滴度平均值=1.78×10~5 CFU/mL。Western blot验证转染后细胞Annexin A3的表达水平明显的上调或下调。MTT法测定细胞耐药指数,敏感细胞系在转染pMSCV-sense anx3后耐药指数上升约2—6倍,生长和增殖受到抑制。耐药细胞系在转染pMSCV-antisense anx3后耐药指数下降约1.2—2.2倍左右,生长和增殖加快。细胞形态均无明显改变。3、在药物作用24h后,顺铂诱导的卵巢癌细胞开始凋亡。其中,耐药细胞系的凋亡率明显低于敏感细胞系。与卵巢癌化疗敏感的细胞株相比,转染正义AnnexinA3的细胞凋亡率明显降低。与卵巢癌化疗耐药的细胞株相比,转染反义Annexin A3的细胞凋亡率明显增高。卵巢癌耐药细胞系在高浓度的顺铂(60ug/ml)作用下,可以观察到凋亡通路蛋白Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3的表达,Survivin的表达水平增高。转染反义pMSCV-antisense anx3后,低浓度的顺铂即可诱导Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3蛋白的表达,Survivin的表达水平则降低。研究结论1、卵巢癌顺铂敏感及耐药细胞系SKOV3和A2780,经过长期体外常规培养、反复冻存,其耐药性仍能维持稳定。与本课题前期研究的细胞相比,耐药细胞的生物学特性无明显的改变。本课题组诱导的SKOV3/CDDP耐药指数较三年前有所下降,但仍良好地维持了其顺铂耐药特性。2、采用基因工程技术分别将含正义或反义Annexin A3序列的逆转录病毒载体转染卵巢癌铂类敏感和耐药细胞后,获得稳定的细胞克隆。进一步验证了AnnexinA3蛋白与铂类耐药的相关性。3、Annexin A3的表达水平可以影响顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡。凋亡相关的线粒体途径和死亡受体途径均参与了这一过程的发生。