背景:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),是一种慢性非特异的肠道炎症性疾病,其病变位于大肠,累及结直肠的粘膜及粘膜下层,以肠道炎症及粘膜损伤为主要病理表现。近年来,我国溃疡性结肠炎的发病率呈现出明显上升的趋势,但溃疡性结肠炎目前在临床上尚无有效的根治方法,导致疾病容易复发、迁延不愈,相当数量的患者最终需要接受手术治疗,对人民群众的健康造成严重影响,并给社会医疗支出带来极大负担。问题的关键在于其发病机制尚未明确,因此,积极探索溃疡性结肠炎的发病机制对其临床精准治疗具有十分重要的意义。虽然溃疡性结肠炎的发病机制尚未明确,但目前认为其发病主要是由患者的遗传易感性、外界环境影响、自身免疫功能失调、肠道菌群紊乱以及肠粘膜屏障受损等多方面异常共同作用所导致。研究证实细胞自噬及SIRT1/mTOR信号通路能够参与炎症、肿瘤、代谢等多种生理病理过程,然而SIRT1在溃疡性结肠炎中是否参与及调节肠上皮组织自噬水平尚未明确,SIRT1/mTOR信号通路在溃疡性结肠炎中的作用机制仍不清楚。由于对溃疡性结肠炎的病因及发病机制缺乏全面深入的认识,目前仍无法根治该病,因此尽快阐述溃疡性结肠炎的发病机理,探索新的治疗靶点,改善疾病预后成为了临床上亟待解决的问题。近年来,中药活性成分作为溃疡性结肠炎治疗的补充疗法(Complementary Medicine,CAM),由于其良好的治疗效果以及更少的毒副作用而受到越来越为广泛的关注。姜黄(Curcuma,CUR)为一种多年生姜黄属草本植物,其作为药材在祖国医学的应用已有数百年历史。2019年欧洲克罗恩病和结肠炎组织(European Cron’s and Colitis Organisation,ECCO)年会指出,姜黄素作为5-ASA的补充疗法,有助于诱导轻度至中度活动性UC的缓解;但在2019年美国胃肠病协会(American Gastroenterological Association,AGA)发布的轻-中度溃疡性结肠炎(UC)的管理指南中指出由于证据有限,对于接受5-ASA治疗的轻-中度溃疡性结肠炎患者,不推荐使用姜黄素治疗。由此可见目前关于姜黄素治疗溃疡性结肠炎的研究正处于起步阶段,相关研究较少,其疗效及作用机制尚存在争议,因此有待进一步深入探索研究。目的:本研究通过体内及体外试验探讨SIRT1/mTOR信号通路在葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的发生、发展中可能的作用机制,并进一步通过体内试验探讨姜黄素对DSS小鼠的治疗作用及其调节机制,同时通过体外细胞实验探讨姜黄素对巨噬细胞的影响,并对上述体内外作用的相关机制进行探讨,并为姜黄素应用于溃疡性结肠炎的临床治疗提供理论和实验基础。方法:(1)将BALB/c小鼠随机分为5组,每组10只,CON组:即正常对照组,该组小鼠常规饲养,不进行任何处理;DSS组:即模型对照组,采用右旋葡聚糖硫酸钠法(3%DSS)制造溃疡性结肠炎小鼠模型;Resveratrol-1组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予40 mg/kg(0.4 mL)白藜芦醇灌胃;Resveratrol-2组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予60 mg/kg(0.4 mL)白藜芦醇灌胃;Resveratrol-3组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予80 mg/kg(0.4 mL)白藜芦醇灌胃。造模之日起,每天观察小鼠大便性状和便血情况,活动、精神、饮食、体重等,并计算小鼠的疾病活动指数。采集各组小鼠结肠组织,制作病理组织切片并进行HE染色,观察病理组织学变化。采用ELISA法检测结肠组织培养液中TNF-α和IL-6表达。免疫荧光染色法检测各组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1、LC3 mTOR和SIRT1的阳性表达。荧光定量PCR和Western blot法检测各组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1、LC3、mTOR和SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平。(2)将BALB/c小鼠随机分为5组,每组10只,CON组:即正常对照组,该组小鼠常规饲养,不进行任何处理;DSS组:即正常对照组,采用右旋葡聚糖硫酸钠法(3%DSS)制造溃疡性结肠炎小鼠模型;Curcumin-1组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予10 mg/kg(0.4 mL)姜黄素灌胃;Curcumin-2组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予25 mg/kg(0.4 mL)姜黄素灌胃;Curcumin-3组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予50 mg/kg(0.4 mL)姜黄素灌胃;采集各组小鼠结肠组织,制作病理组织切片并进行HE染色,观察病理组织学变化。采用ELISA法检测结肠组织培养液中TNF-α和IL-6表达。免疫荧光染色法检测各组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1、LC3、mTOR和SIRT1表达。荧光定量PCR和Western blot法检测各组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1、LC3、mTOR和SIRT1mRNA和蛋白的表达。(3)BALB/c小鼠适应性喂养7d后随机分为6组,每组10只,CON组:即正常对照组,该组小鼠常规饲养,不进行任何处理;DSS组:即正常对照组,采用右旋葡聚糖硫酸钠法(3%DSS)制造溃疡性结肠炎小鼠模型;DSS+Cur组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予50 mg/kg(0.4 mL)姜黄素灌胃;DSS+Res组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予80 mg/kg(0.4 mL)白藜芦醇灌胃。Eve+Cur组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予50 mg/kg(0.4 mL)姜黄素灌胃,随后每天给予小鼠mTOR抑制剂Everolimus(2.5 mg/kg);Eve+Res组:采用DSS法制造溃疡性结肠炎小鼠模型,给予80 mg/kg(0.4 mL)白藜芦醇灌胃,随后每天给予小鼠mTOR抑制剂Everolimus(2.5 mg/kg)。分离培养各组小鼠结肠组织巨噬细胞。采用CCK-8法检测各组小鼠结肠组织巨噬细胞的增殖活性,流式细胞术检测各组小鼠结肠组织巨噬细胞凋亡情况。采用ELISA法检测各组巨噬细胞培养上清中IL-6、TNF-α的表达,同时检测巨噬细胞中LC3、Beclin-1、Atg12 mRNA和蛋白的表达。采用荧光定量PCR和Western blot法分别检测Everolimus干预后细胞中mTOR和SIRT1 mRNA和蛋白的表达,采用ELISA法检测Everolimus干预后巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α表达。结果:(1)与CON组相比,DSS组小鼠在第14天时的死亡率为50%,且Sirt1/mTOR信号通路被抑制,其中与CON组相比,DSS组中mTOR、SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。而在白藜芦醇处理组中,DSS引起的结肠炎小鼠的存活率上升至83.3%;并且白藜芦醇恢复了Sirt1/mTOR信号通路激活,其中与DSS组小鼠相比,各白藜芦醇浓度组小鼠结肠组织中mTOR、SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)。DSS组小鼠的体重从第4天开始下降,与正常小鼠相比明显减少(P<0.05)。白藜芦醇处理组中,DSS引起的结肠炎小鼠的体重较DSS组明显减轻(P<0.05)。与CON组相比,DSS组与白藜芦醇处理组小鼠的疾病活动指数评分(disease activity index,DAI)均明显增高(P<0.05);但与DSS组相比,各白藜芦醇处理组小鼠的DAI评分均显著降低(P<0.05)。本研究还发现,白藜芦醇治疗改善了DSS诱导的肠炎小鼠腹泻和便血等症状(P<0.05)。与CON组相比,DSS组小鼠的结肠长度显著缩短(P<0.05)。与DSS组相比,白藜芦醇处理的DSS小鼠的结肠长度明显长于DSS组(P<0.05),表明结肠长度有所改善,并且几乎完全恢复到正常长度。CON组小鼠结肠壁粘膜层完整,未观察到明显的炎性细胞浸润;与CON组相比,DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的结肠粘膜腺体可见明显缺失,有大量炎性细胞浸润至粘膜层和粘膜下层,部分样本中可观察到炎性细胞浸润至肌层组织,有的甚至达到粘膜层脂肪组织,粘膜下层发生水肿,腺体以及杯状细胞数量减少甚至消失,粘膜上皮结构不完整;在不同浓度白藜芦醇处理的小鼠中,结肠粘膜损伤较DSS组有所改善,视野下可观察到炎性细胞浸润程度降低,结肠粘膜上皮细胞完整性有所转归,腺体和杯状细胞数量较DSS组明显增多,粘膜下层水肿情况有所缓解。CON组相比,DSS组中TNF-α和IL-6的表达水平显著升高(P<0.05)。在第7天时,白藜芦醇作用于DSS小鼠后抑制了TNF-α和IL-6表达水平的增加(P<0.05)。在第14天时,白藜芦醇作用后TNF-α和IL-6表达水平较DSS组明显降低(P<0.05),与第7天时类似。与CON组相比,DSS组小鼠中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白的表达水平明显增加(P<0.05);与DSS组小鼠相比,各白藜芦醇浓度组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。(2)在姜黄素处理组中,DSS引起的结肠炎小鼠的存活率为66.7%,较DSS组明显增高。姜黄素处理后,DSS引起的结肠炎小鼠的体重较DSS组明显减轻(P<0.05)。姜黄素处理组小鼠的DAI分均显著降低(P<0.05)。此外,姜黄素治疗改善了DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠腹泻和便血等症状(P<0.05)。与DSS组相比,用姜黄素处理的DSS小鼠的结肠长度明显增加(P<0.05)。在不同浓度姜黄素处理的小鼠中,结肠粘膜损伤较DSS组有所改善,视野下可观察到炎性细胞浸润程度降低,结肠粘膜上皮细胞完整性有所转归,腺体和杯状细胞数量较DSS组明显增多,粘膜下层水肿情况有所缓解。CON组相比,DSS组中TNF-α和IL-6的表达水平显著升高(P<0.05)。在第7天时,姜黄素作用于DSS小鼠后抑制了TNF-α和IL-6表达水平的增加(P<0.05)。在第14天时,姜黄素作用后TNF-α和IL-6表达水平较DSS组明显降低(P<0.05),与第7天时类似。与CON组相比,DSS组小鼠中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白的表达水平明显增加(P<0.05);与DSS组小鼠相比,各姜黄素浓度组小鼠结肠组织中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。与CON组相比,DSS组中mTOR、SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05);与DSS组小鼠相比,各姜黄素浓度组小鼠结肠组织中mTOR、SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)。(3)与CON组相比,DSS组、DSS+Cur组和DSS+Res组巨噬细胞的增殖活性均明显增高(P<0.05);与DSS组相比,DSS+Cur组和DSS+Res组细胞的增殖活性则显著降低(P<0.05)。与CON组相比,DSS组、DSS+Cur组和DSS+Res组巨噬细胞的凋亡率均明显降低(P<0.05);与DSS组相比,DSS+Cur组和DSS+Res组巨噬细胞的凋亡率均明显增高(P<0.05)。与CON组相比,DSS组巨噬细胞中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA的表达水平明显增加(P<0.05);与DSS组相比,DSS+Cur组和DSS+Res组巨噬细胞中Atg12、Beclin-1和LC3 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。进一步用Western blot法检测各组细胞中Atg12、Beclin-1和LC3蛋白的表达,结果显示与CON组相比,DSS组巨噬细胞中Atg12、Beclin-1和LC3蛋白的表达水平明显增加(P<0.05);与DSS组相比,DSS+Cur组和DSS+Res组巨噬细胞中Atg12、Beclin-1和LC3蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。与CON组相比,DSS组、Cur组、Res组、Eve+Cur组、Eve+Res组巨噬细胞中mTOR和SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);与DSS组相比,Cur组和Res组巨噬细胞中mTOR和SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.05);而与Cur组和Res组相比,Eve+Cur组和Eve+Res组巨噬细胞中mTOR和SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。与CON组相比,DSS组巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α的表达水平明显增高(P<0.05);与DSS组相比,Cur组和Res组巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α的表达水平明显降低(P<0.05);与Cur组和Res组相比,Eve+Cur组和Eve+Res组巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α的表达水平则显著升高(P<0.05)。结论:(1)DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的SIRT1/mTOR信号通路被抑制。SIRT1激活剂白藜芦醇能够有效逆转DSS对SIRT1/mTOR信号通路的抑制作用,从而抑制溃疡性结肠炎的发生和发展,缓解病情。提示SIRT1/mTOR信号通路参与了溃疡性结肠炎小鼠炎症反应及自噬的调节,在溃疡性结肠炎的发生、发展过程中起到了重要作用。(2)姜黄素能够有效抑制由DSS诱导的溃疡性结肠炎的发生和发展,缓解病情。姜黄素的作用机制可能与其缓解炎症反应,减少自噬相关基因表达及促进自噬相关的SIRT1/mTOR信号通路传导活化有关。(3)姜黄素能够抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠组织巨噬细胞的增殖,促进其凋亡,抑制炎症和自噬的发生,而上述作用是通过调控SIRT1/mTOR信号通路实现的。