90％的胰腺癌为具有特殊组织结构的胰腺导管腺癌，癌组织缺乏功能正常的血管，且癌细胞分散在丰富的纤维间质组织中，抗癌药物难以渗入来发挥作用,加之药物的快速代谢导致化疗药物不敏感,而全身抗癌药物的干预治疗致使胰腺癌肿瘤局部治疗低效能且全身副作用大，探索一种安全高效的给药方式将为胰腺癌治疗带来新的契机。本研究内容是依托国家自然基金面上项目“可视化双靶向载dFdC金纳米微囊同步UTMD增强胰腺癌化疗效果及瞬时成像的实验研究”，以对人体无毒害作用的生物可降解材料聚乳酸羟基乙酸－聚乙二醇(PLGA-mPEG）为骨架，将一线广谱抗肿瘤药物紫杉醇（PTX）包裹后，靶向胰腺癌高表达肿瘤标志物CA19-9及CEA，复乳法制备形成特殊的“多空穴”结构，探索超声辐照微泡破裂（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）在增强靶向载药“多空穴”纳米微囊进入胰腺癌细胞的可行性，并进一步筛选UTMD的优化条件，在实现特异性识别、黏附靶细胞并发挥抗胰腺癌治疗作用的同时，利用复合纳米微囊本身独特的内部“多空穴”特性来实现超声造影增强显像的实验研究。本研究主要完成了靶向载药纳米诊疗体的制备和表征,体内外超声造影显像及体外抗胰腺癌治疗的实验部分。具体内容以三部分形式展开：　　第一部分、靶向载PTX PLGA-mPEG纳米诊疗体的制备与表征　　目的：以生物可降解有机高分子共聚物PLGA-mPEG为骨架，构建靶向CA19-9，CEA，包裹 PTX的纳米诊疗体。并对其粒径分布、大小形态、表面电荷及枝接抗体情况等理化特性进行表征，并检测PTX包封率，载药率及体外释放规律。　　方法：采用复乳法制备靶向载PTX的PLGA- mPEG“多空穴”纳米诊疗体微囊，并通过设计多因素多水平的正交实验对制备条件进行优化，方差统计，最终得出最优制备条件。超细微粒粒度及电位分析仪对所构建的靶向载 PTX纳米诊疗体最大及平均粒径分布及其表面所携带电荷进行表征，扫描电镜检测其大小、形态和分散度情况，红外光谱检测其枝接抗体情况，在进一步对高效液相色谱法测定包封率及释放率进行方法学验证之后，检测纳米微囊对于PTX的包封率，载药率及体外释放规律，验证纳米微囊对于PTX的稳定释放功能，描记“时间-PTX体外释放曲线”。　　结果：通过正交实验确定了制备PTX-mPEG-PLGA纳米微囊4个因素(A:初乳乳化次数，B:PTX投药比，C:油相体积，D:F-68浓度)对包封率及载药率的影响程度，确定最佳制备工艺参数。复乳法最终成功制备靶向载PTX的PLGA-mPEG“多空穴”纳米微囊。粗测靶向纳米诊疗体微囊的最大粒径约为136.3±5.2nm，平均粒径约为88.6±3.5nm，Zeta电位为-13.6±1.7mv，扫描电镜证实anti-CA19-9-CEA-PTX-mPEG-PLGA靶向纳米诊疗体微囊呈球形、表面光滑、分布均匀、无明显团聚现象，观测得到纳米微囊粒径在粗测得到的粒径范围之内。高效液相色谱法方法可靠，经测得PTX包封率为91.32±3.25%，载药率为2.666±0.092%。纳米微囊在5天内可以持续稳定的释放PTX，累计释放量达96％。红外光谱法检测纳米微囊诊疗体所得光谱具有特征性的枝接抗体蛋白的光谱信息,间接证明微囊表面已修饰anti-CA19-9、anti-CEA抗体。　　结论：复乳法可以成功制备anti-CA19-9-CEA-PTX-mPEG-PLGA靶向纳米诊疗体，其本身具有独特的“多空穴”结构，及良好的包封率、载药率、靶向性及体外持续稳定释放 PTX功能，理论上能达到超声造影增强显像和靶向抗胰腺癌治疗的要求，为进一步的实验打下了良好的前期基础。　　第二部分、靶向载PTX纳米诊疗体体外及体内超声造影增强显像的实验研究　　目的：评估靶向载PTX纳米诊疗体微囊体外及体内超声造影增强显像情况。　　方法：彩色多普勒诊断超声诊断仪Philips IE33，Siemens Sequaio512和LOGIQ E9（探头L11-3，15L8W-S，ML6-14）。分为三组:第一组：5ml脱气生理盐水注入5ml塑料软管并封闭；84mg靶向载PTX纳米诊疗体冻干粉放入5ml塑料软管注入脱气生理盐水5ml并封闭，充分振摇；84mg SonoVue注入5ml脱气生理盐水并注入塑料软管封闭,充分振摇；常规二维超声及超声造影模式下分别观察3个软管内显像情况。第二组：0.5ml脱气生理盐水经兔耳缘静脉快速注入,立即常规二维超声及超声造影模式下观察兔肾脏显像情况。84mg靶向载 PTX纳米诊疗体冻干粉放入5ml塑料软管注入脱气生理盐水5ml并封闭，充分振摇；84mg SonoVue注入5ml脱气生理盐水并注入5ml塑料软管封闭,充分振摇；从每个软管内各抽取0.5ml充分摇匀经兔耳缘静脉快速注入,常规二维超声及超声造影模式下观察兔肾脏显像情况，记录兔肾脏时间-强度曲线。第三组：0.2ml脱气生理盐水经裸鼠尾静脉快速注入,立即常规二维超声及超声造影模式下观察裸鼠胰腺癌体表种植瘤显像情况。84mg靶向载PTX纳米诊疗体冻干粉放入5ml塑料软管注入脱气生理盐水5ml并封闭,充分振摇；84mgSonoVue注入5ml脱气生理盐水并注入5ml塑料软管封闭,充分振摇;之后分别各抽取0.2ml混悬液再次充分摇匀，经裸鼠尾静脉快速注入,立即常规二维超声及超声造影模式下观察裸鼠胰腺癌体表种植瘤显像情况，并描记胰腺癌体表种植瘤时间-强度曲线。第四组：0.2ml脱气生理盐水经裸鼠尾静脉快速注入,立即常规二维超声及超声造影模式下观察裸鼠胰腺癌原位种植瘤显像情况。84mg靶向载PTX纳米诊疗体冻干粉放入5ml塑料软管注入脱气生理盐水5ml并封闭，充分振摇；84mg SonoVue注入5ml脱气生理盐水并注入5ml塑料软管封闭,充分振摇；从软管内各抽取0.2ml充分摇匀经裸鼠尾静脉快速注入，立即常规二维超声及超声造影模式下观察裸鼠胰腺癌原位种植瘤显像情况，并描记胰腺癌原位种植瘤时间-强度曲线。　　结果:　　1.体外超声造影增强显像：常规二维模式：脱气水呈现无回声，SonoVue呈现粗点状增强回声，靶向载 PTX纳米诊疗体呈现细点状增强回声。超声造影模式：超声造影显像(和常规二维模式比较)：脱气水呈现无回声，SonoVue呈现多量粗点状增强回声,靶向载PTX纳米诊疗体呈现多量细点状增强回声,后两者在超声造影模式下显像均较常规二维模式下偏强。　　2.体内超声对比增强显像:(1)兔肾:脱气生理盐水在超声造影模式下无对比增强显像。载PTX纳米诊疗体和SonoVue对于兔肾达到充盈高峰时两者增强显像效果均较好，动态造影过程：①靶向载PTX纳米诊疗体混悬液注入后约5秒钟开始充盈，24秒快速达到高峰之后维持约6秒，约30秒时快速消退，到48秒开始缓慢消退，约8分钟才基本完全消退。② SonoVue混悬液注入后约3秒钟开始充盈，28秒快速达到高峰，之后维持约8秒，快速消退，约47秒时开始缓慢消退，在5分钟之内基本消退完全。靶向载 PTX纳米诊疗体达峰时间较SonoVue略提前，但峰值较SonoVue略偏低，消退较SonoVue减慢。(2)裸鼠胰腺癌体表种植瘤:脱气生理盐水在超声造影模式下无对比增强显像。靶向载PTX纳米诊疗体和SonoVue对于裸鼠胰腺癌体表种植瘤达到充盈高峰时两者增强显像效果均较好。动态造影过程：①靶向载 PTX纳米诊疗体混悬液注入后瘤体约8秒快速充盈，从外周向中心向心性充盈，约33秒左右充盈完全，之后先快速消退，再缓慢消退，约10分钟仍有散在星点状回声。② SonoVue混悬液注入后瘤体约5秒钟开始充盈，从外周向中心呈向心性充盈，约35秒充盈达峰，维持大约6秒钟，之后先快速消退，再缓慢消退，约9分50秒左右基本消退完全。靶向载PTX纳米诊疗体和SonoVue在造影充盈过程中均呈快速充盈，达峰时间基本一致，充盈强度前者较后者略低一点，消退时纳米诊疗体较SonoVue减慢，呈缓慢消退的过程，显示纳米诊疗体在瘤体中呈现明显滞留时间延长。(3)裸鼠胰腺癌原位种植瘤:脱气生理盐水在超声造影模式下无对比增强显像。靶向载PTX纳米诊疗体和SonoVue对于裸鼠胰腺癌原位种植瘤达到充盈高峰时两者增强显像效果均较好，且靶向载PTX纳米诊疗体较SonoVue充盈强度更强，尤其对于原位瘤瘤体内的充盈。动态造影过程:①靶向载 PTX纳米诊疗体混悬液注入后周围及中心约33秒同时开始充盈至70秒快速充盈达峰，之后开始消退，约150秒消退速度明显减慢，至约10分钟，原位瘤的强度仍约为1/3最大充盈强度，一直至约14分钟，瘤体内仍有星点状回声未消退。②SonoVue混悬液注入后瘤体周围及中心约30秒同时开始充盈，至60秒全部充盈，维持约8秒钟，开始快速消退，约110秒消退速度减慢，至10分钟接近消退完全。靶向载PTX纳米诊疗体和SonoVue在造影充盈过程中均呈快速充盈，达峰时间基本一致，充盈强度前者较后者略增强，消退时纳米诊疗体较SonoVue减慢，呈缓慢消退的过程。　　结论：靶向载PTX纳米诊疗体和SonoVue在体外及兔肾、裸鼠胰腺癌体表及原位种植瘤超声造影增强显像效果均较好，靶向载PTX纳米诊疗体较SonoVue消退时间明显延长，在裸鼠体内胰腺肿瘤有明显的滞留现象，相对延长了PTX在肿瘤等靶组织停留的时间，为今后抗肿瘤治疗提供了一定的治疗基础。　　第三部分、优化后UTMD促进靶向载PTX纳米诊疗体体外抗胰腺癌的实验研究　　目的：　　1.筛选增强纳米微囊进入胰腺癌细胞的UTMD优化条件。　　2.有/无优化UTMD作用下，不同时间点胰腺癌细胞对于纳米微囊的摄取情况，观察被动靶向、主动靶向、物理靶向及联合靶向促进纳米微囊进入胰腺癌细胞情况。　　3.检测纳米材料及超声/加微泡对于细胞的毒性作用。　　4.UTMD介导靶向载PTX纳米诊疗体杀死胰腺癌细胞的体外抗肿瘤作用。　　方法：　　1.根据课题组前期工作基础及文献报道，设定20个筛选条件，将包载FITC的靶向纳米微囊与CFAPC-1胰腺癌细胞共同孵育，即刻分别依次进行每个筛选条件的干预，干预完马上观察细胞状态并且上机进行流式细胞学检测，在细胞生长状态良好的前提之下，筛选出胰腺癌细胞对于纳米微囊的最大摄取率所对应的UTMD条件即最优UTMD条件。　　2.使用倒置荧光显微镜，激光共聚焦显微镜，流式细胞学检测在优化超声条件/加微泡作用下促进靶向/非靶向载RhB纳米微囊进入胰腺癌细胞的情况。(1)被动及主动靶向性分组:①空白对照组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;②游离罗丹明组(RhB)：检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;③非靶向载RhB纳米微囊组(NCs)：检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;④靶向载RhB纳米微囊组(NCs-T):检测4个时间点：6h，12h，24h，48h。(2)物理及联合靶向性分组：①单纯游离RhB组：检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;②RhB+US组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;③RhB+UTMD组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;④单纯非靶向包载RhB纳米微囊(NCs)组：检测4个时间点:6h，12h，24h，48h;⑤非靶向包载RhB纳米微囊(NCs)+US组：检测4个时间点:6h，12h，24h，48h;⑥非靶向包载RhB纳米微囊(NCs)+UTMD组：检测4个时间点:6h，12h，24h，48h;⑦单纯靶向包载RhB纳米微囊(NCs-T)组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;⑧靶向包载RhB纳米微囊(NCs-T)+US组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h;⑨靶向包载RhB纳米微囊(NCs-T)+UTMD组:检测4个时间点：6h，12h，24h，48h。　　3. MTT法检测：不同条件下空纳米微囊材料和胰腺癌细胞孵育24h，48h后细胞增殖情况，及优化超声/加微泡干预下24h，48h后胰腺癌细胞增殖情况。具体分组：①单纯PLGA-mPEG空白纳米微囊24h组，② PLGA-mPEG空白纳米微囊+ US24h组，③ PLGA-mPEG空白纳米微囊+UTMD24h组，④单纯PLGA-mPEG空白纳米微囊48h组，⑤PLGA-mPEG空白纳米微囊+US48h组，⑥PLGA-mPEG空白纳米微囊+UTMD48h组，⑦PBS24h组，⑧SonoVue24h组4. CCK-8法检测24h后，48h后不同分组条件下胰腺癌细胞增殖情况。具体分组：(1)24h：①单纯PTX组，②PTX+US组，③PTX+UTMD组，④单纯PTX-NCs组，⑤PTX-NCs+US组，⑥PTX-NCs+UTMD组，⑦单纯PTX-NCs-T组，⑧PTX-NCs-T+US组，⑨PTX-NCs-T+UTMD组，⑩空白对照组；(2)48h：①单纯PTX组，②PTX+US组，③PTX+UTMD组，④单纯PTX-NCs组，⑤PTX-NCs+US组，⑥PTX-NCs+UTMD组，⑦单纯PTX-NCs-T组，⑧PTX-NCs-T+US组，⑨PTX-NCs-T+UTMD组，⑩空白对照组　　结果：　　1.优化UTMD条件筛选：超声辐照功率/辐照时间/SonoVue体积比:1w/cm2/60s/40%条件下胰腺癌细胞摄取率最大为：39.67±2.45%。　　2.靶向性验证：　　(1)被动靶向性：6h-12h-24h-48h:(RhB)组：随时间推移，进入细胞快速，至12h达峰，之后细胞内荧光减退，逐渐析出。游离RhB12h细胞摄取率在4个时间点中最高，较6h具有明显统计学差异（P<0.05）。(NCs)组：随时间推移，进入细胞缓慢增加，至48h达峰。(NCs)组：细胞48h摄取率在4个时间点中最高，较6h具有明显统计学差异（P<0.05）。(NCs-T)组：随时间推移，进入细胞缓慢增加，至48h达峰。NCs-T细胞48h摄取率在4个时间点中最高，较6h具有明显统计学差异（P<0.05）。　　(2)主动靶向性：6h：(RhB)组：细胞摄取率4组中最高；(NCs)组：细胞摄取率较(RhB)组略低；(NCs-T)组：细胞摄取率较(NCs)组略高。12h：(RhB)组：细胞摄取率4组中最高；(NCs-T)组：细胞摄取率较(NCs)组高。24h：(RhB)组：细胞摄取率4组中最低；(NCs)组：细胞摄取率较(RhB)组高；(NCs-T)组：细胞摄取率较(NCs)组增高。48h后:(RhB)组：细胞摄取率4组中最低；(NCs)组：细胞摄取率较(RhB)组高；(NCs-T)组：细胞摄取率较(NCs)组明显增高，并具有统计学意义(P<0.05)。　　(3)物理靶向性：各时间点，细胞对于纳米微囊摄取率的影响，UTMD和US两者较没有US作用下细胞摄取率均增高，在6h，24h和48h为著，并均具有统计学意义(P<0.05)，UTMD和US比较，两者在提高细胞摄取率上没有明显统计学差异(P>0.05)。　　(4)联合靶向性：(NCs-T)组较(NCs)组，细胞摄取率增高，以48h为著，而(NCs-T+US)组及(NCs-T+UTMD)组较(NCs-T)组各时间点细胞摄取率进一步增高，以12h，24h和48h为著,并具有统计学上显著性差异(P<0.05)。　　3.在PBS，SonoVue，空纳米微囊，空纳米微囊+优化US条件，空纳米微囊+优化UTMD条件各组干预24h及48 h之下，胰腺癌细胞的增殖率均在90%之上，各组之间没有明显的统计学差异(P>0.05)。　　4.CCK-8实验验证靶向载药纳米诊疗体体外抗肿瘤效果：　　(1) PTX裸药组、PTX-NCs组、PTX-NCs-T组三组，在分别与胰腺癌细胞孵育24h和48h之后，每组细胞存活率随药物浓度的增加，逐渐呈下降趋势。　　(2)PTX裸药组在48h细胞存活率较24h每个对应浓度降低，但降低幅度较小，PTX-NCs组及PTX-NCs-T组48h细胞存活率较24h每个对应浓度降低，但降低幅度较大，和PTX裸药组比较有统计学意义（P<0.05）。　　(3) PTX裸药组、PTX-NCs组、PTX-NCs-T组三组分别在US及UTMD干预之下，每组细胞存活率随载药物浓度的增加，均呈逐渐下降趋势。　　(4)分别在24h和48h，PTX-NCs+US组及PTX-NCs+UTMD组较单纯PTX-NCs组细胞存活率对应浓度有较大幅度下降（P<0.05）；PTX-NCs-T+US组及PTX-NCs-T+UTMD组较单纯PTX-NCs-T组细胞存活率对应浓度有较大幅度下降（P<0.05）。　　(5)分别在24h和48h，PTX-NCs+US组及PTX-NCs+UTMD组两组间对应浓度细胞存活率无显著性差异。（P>0.05）；PTX-NCs-T+US组及PTX-NCs-T+UTMD组两组间对应浓度细胞存活率无显著性差异。（P>0.05）。　　结论：　　1.优化的US及UTMD条件下，可以在保证细胞存活率的前提下，有效促进靶向纳米微囊进入胰腺癌细胞。　　2.　　①RhB在24h之后随时间推移而进入细胞逐渐减少，可能因为小分子量的染料分子可以自由进出细胞膜，所以随时间推移，进入细胞的一部分又从细胞内游弋出来。而非靶向载PTX纳米微囊因其足够小巧的粒径具有被动靶向的功能，从而随时间的延长而持续地进入细胞增多。靶向载 PTX纳米微囊较非靶向纳米微囊进入细胞增多，和靶向的抗原-抗体寻靶结合有一定关系，且无论是靶向还是非靶向纳米微囊的粒径相对于罗丹明染料分子来说大很多，不易从细胞内游弋出来。这与纳米微囊在之前裸鼠体内显像的停留时间延长相一致。　　②US及UTMD可以明显增强靶向及非靶向纳米微囊进入细胞，除与“声孔效应”直接相关，可能还和其他一些广泛研究的不完全明了的一些机制有关.　　③而US和UTMD对于促进纳米微囊进入细胞内部的效能比较接近，是否和超声辐照作用之下形成可逆性声孔的饱和度相关。　　3.MTT试验结果显示PLGA-mPEG材料、优化的US、优化的UTMD作用下细胞存活率基本在90%以上，表明所使用PLGA-mPEG材料、SonoVue、US、UTMD条件的安全性。　　4.US及UTMD作用下可以增强靶向载药纳米诊疗体微囊进入细胞的有效数量，从而促进了纳米诊疗体体外抗肿瘤作用。