研究背景与目的：诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是一类与胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）具有相似全向分化潜能的干细胞，体外可分化为神经干细胞（Neural Stem Cells，NSC）、神经元等用于中枢神经系统疑难疾病的细胞替代治疗，临床应用前景广阔，有望成为干细胞移植治疗的新的种子细胞来源。然而，目前人们对iPSCs向NSC分化的调控机制知之甚少，要获得数量丰富且来源稳定的iPSCs源性的NSC用于临床治疗还存在相当的技术困难。因此，进一步了解iPSCs向NSC定向分化的具体调控机制，对于iPSCs将来的临床推广应用意义重大。由于iPSCs与ESC生物学特性极其相似,而ESC的自我更新和定向分化机制又一直是生命科学领域的研究热点和重点,这就为我们深入探讨诱导iPSCs向NSC分化的调控机制提供了必要的前提和基础。研究表明ESC的自我更新和定向分化受Notch、Wnt等外部信号通路、转录因子、和表观遗传修饰等多种因素的调控。Notch通路是生物体极其重要的信号传导通路之一，其在干细胞的增殖和分化等方面均起着重要的作用。Notch受体与配体结合激活时，干细胞就表现为增殖；当Notch信号通路被抑制时，干细胞就分化为功能细胞。微小RNA（microRNA，miRNA）在生物体发生发育、干细胞增殖分化和肿瘤发生发展中同样发挥着极其重要的调控作用，在人类，microRNA能够调控至少30%的基因，一个microRNA可负调控数百个靶基因的蛋白表达，几乎可参与调控所有的生物学过程。诸多文献研究提示在ESC的NSC定向分化过程中，microRNA能够调控可下调干细胞内维持其未分化状态的基因表达水平，同时激活干细胞谱系特异性基因，从而促进ESC定向分化。然而目前尚未见iPSCs神经定向分化相关调控机制的研究报道,为探讨iPSCs向NSC定向分化的机制以及iPSCs来源的NSC对缺血性脑损伤疾病的修复效果，本课题拟分为体外实验及体内实验两部分：体外实验首先将iPSCs定向分化为NSC，利用实时定量PCR、Western blot等方法检测分化过程中各时间点Notch信号分子、miRNAs的表达变化，初步探讨Notch信号分子、miRNAs与iPSCs向NSC定向分化过程的关系；体内实验拟通过将iPSCs来源的NSC立体定向移植至大鼠中动脉栓塞模型（middle cerebral arterial occlusion，MCAO）模型中，观察其对大鼠缺血性脑损伤所致神经功能缺陷的修复作用，为利用干细胞和再生医学技术治疗中枢神经系统疑难疾病提供新的理论依据和技术准备。研究内容和方法：1体外实验1.1人iPSCs的培养及向NSC的诱导分化：采用本课题组已建立的培养及分化体系培养人iPSC细胞并诱导其向NSC分化，应用免疫荧光染色对分化后的细胞进行NSC标志物Nestin、Sox2表达的鉴定。1.2采用实时荧光定量PCR检测分化过程中mir-9，mir-34a、mir-200b的表达，与iPS组比较，观察mir-9，mir-34a、mir-200b的动态表达变化。1.3采用实时荧光定量PCR检测分化过程中Notch1、Hes1的基因表达水平，与iPS组比较，观察Notch1、Hes1基因的动态表达变化。1.4采用免疫荧光染色和Western blot法检测诱导过程中Notch1、Hes1的蛋白表达水平，与iPS组比较，观察诱导过程中Notch1、Hes1蛋白的表达变化。1.5利用Notch信号阻断剂DAPT进一步验证Notch信号通路在iPSCs向NSC定向分化过程中的作用。实验分为RA对照组，DAPT诱导组，RA+DAPT诱导组，RA+DMSO对照组；倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化，实时荧光定量PCR诱导第7天的各组细胞Nestin、β-tubulinШ、GFAP、Notch1和Hes1基因的表达情况，免疫荧光染色同时检测Nestin、β-tubulinШ、和GFAP蛋白的表达。2体内实验2.1参考Longa法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，CM-DiI标记iPS来源的NSC进行大鼠纹状体立体定向移植，观察移植的NSC在大鼠脑内的存活、迁移状况，并以免疫荧光染色法检测神经细胞相关标志物Nestin，β-tublinIII，GFAP的变化，以观察其分化情况。同时利用平衡木行走实验、抓握实验及水迷宫实验对大鼠进行神经功能测评。结果：1体外实验1.1成功将iPSCs诱导分化为NSC。 iPSCs经RA结合无血清培养基诱导3天后，可观察到细胞球形成神经rosette结构，免疫荧光染色显示细胞球呈Nestin及Sox2阳性表达，贴壁培养1个月后，细胞形成神经网络状结构，免疫荧光鉴定提示细胞高表达NSC标志物Nestin及Sox2。1.2实时荧光定量PCR结果显示，与iPSCs组相比较，mir-9、-34a、-200b的表达水平在iPSCs的NSC定向分化过程中显著上调。1.3实时荧光定量PCR结果显示，在iPSCs形成EB的过程中，与iPSCs组相比较， Notch1和Hes1mRNA的表达明显上调，随着RA及无血清培养基诱导iPSCs分化的开始，Notch1和Hes1mRNA的表达下调。1.4免疫荧光染色结果显示，与自然分化组比较，诱导28d后RA无血清培养基诱导组的Notch1以及Hes1蛋白表达的阳性细胞率显著下降，Western blot结果也显示，在iPSCs向NSC的分化过程中, Notch1、Hes1蛋白的表达随着RA结合无血清培养基诱导分化，Notch1、Hes1蛋白的表达逐渐降低，诱导分化后贴壁培养14d时最低，而后表达水平逐渐增高。1.5DAPT加入后，大部分细胞球容易贴壁，细胞球周围可见爬出细长的神经丝样触角；第3d左右，贴壁的细胞球内可见大量神经rosette结构，培养2W后，细胞球分化形成神经网络状结构。结合实时荧光定量PCR和免疫荧光鉴定各诱导组神经标志物Nestin、β-tubullinIII及GFAP的表达结果表明， DAPT能够促进iPSC向NSC的定向分化；与RA对照组及RA+DMSO对照组比较，加入DAPT后，iPSC向NSC的分化速度加快，同时神经元细胞及少突胶质细胞所占分化后细胞的比例也增加，说明加入DAPT后，Notch信号被抑制，使得iPSC能够快速的向NSC定向分化，而由于DAPT对Notch信号的抑制作用是持续的，使得部分NSC继续分化为神经元及少突胶质细胞。2体内实验2.1移植后iPSCs来源的NSC在大鼠脑组织内能够长期存活，移植1周和2周后免疫荧光染色提示移植区和脑缺血区分别可见移植细胞，且细胞分别表达神经细胞标志物β-tubulinШ、GFAP，表明移植后的细胞在脑组织内能够向缺血区迁移并进一步分化为神经细胞；分别利用抓握实验、平衡木行走实验及水迷宫实验在模型制备后0，1，2，3W对各组SD大鼠进行评分，与正常组比较，大鼠脑缺血损伤后各项神经功能检测指标均明显降低；与对照组比较，NSC细胞移植组在移植2周后大鼠的抓握力、平衡行走能力和记忆功能均有一定程度的恢复。结论：1. RA结合无血清培养基诱导法能够有效将人iPSCs定向分化为NSC；2. Notch信号通路参与了人iPSCs向NSC定向分化过程的调控；3. mir-9、-34a及mir-200b有可能通过调控Notch信号参与了人iPSCs向NSC定向分化的调控；4. iPSCs来源的NSC定向移植至MCAO大鼠脑组织后能够长期存活，定向迁移至脑缺血区并分化为神经细胞，一定程度促进大鼠脑缺血损伤后的神经功能恢复。