目的:动脉粥样硬化（AS）是一种以动脉管腔阻塞并伴有粥样斑块形成为特征的慢性炎症性血管疾病。已经证实,AS是心血管疾病如心绞痛、心肌梗死和周围血管疾病发生的主要诱因和病理过程。半个多世纪以来,AS一直是西方国家发病率和死亡率的首要原因,目前也是全球的主要死亡原因。因此,研究AS起始和发展的潜在机制尤为重要。正常成熟的血管平滑肌细胞（VSMCs）表现为增殖弱、合成差、分泌少的收缩表型,且高度表达收缩表型标志蛋白calponin、SMMHC、MLCK、α-SMA和SM22α,而几乎不表达合成表型标志蛋白OPN。在AS形成与发展的病理过程中,VSMCs通过下调收缩表型标志蛋白的表达,并上调合成表型标志蛋白的表达而从收缩状态转变为合成状态,这个过程被称之为VSMCs去分化或表型转化。VSMCs去分化广泛存在于心血管疾病如AS、内膜增生、动脉硬化、高血压、血管成形术后再狭窄和动脉夹层中。阐明VSMCs去分化的潜在机制可为这些疾病的预防和治疗提供新靶点。异常VSMCs的增殖和迁移是包括AS和再狭窄在内的许多心血管疾病病理过程中关键的细胞事件。VSMCs的过度增殖和迁移与VSMCs去分化密切相关,是AS、再狭窄和静脉旁路移植失败的常见病理状态。针对VSMCs去分化的治疗措施有利于改善这些与VSMCs过度增殖和迁移相关的病变情况。面对AS中的血管损伤刺激,炎症细胞、血小板和VSMCs会释放炎症因子和生长因子,特别是血小板源生长因子（PDGF）,导致VSMCs从分化表型转变为去分化表型。PDGF家族是一组调节细胞生长和分裂的内源性生长因子。其中PDGF-BB被认为是研究AS中VSMCs去分化、增殖和迁移最有效的刺激蛋白。因此,本研究通过体外使用PDGF-BB诱导人主动脉平滑肌细胞（HASMC）来探究AS中VSMCs去分化、增殖和迁移的分子机制。配对盒（Pax）基因家族编码一组具有高度保守配对盒DNA结合域的转录因子。Pax基因在形态发生、器官形成、细胞增殖、细胞分化和肿瘤发生等方面发挥着重要作用。Pax9作为Pax基因家族中的一员,是调控牙齿发育最重要的转录因子之一,在胸腺、甲状旁腺、鳃后体、颅骨、喉的骨骼成分以及远端肢体的正常发育过程中也发挥着不可或缺的作用。此外,Pax9缺陷小鼠表现出主动脉弓和血管流出道的发育缺陷,揭示了Pax9还可对心血管发育造成影响。然而,尚不清楚Pax9是否参与AS中VSMCs生物学行为的改变。Sonic hedgehog（Shh）是一种形态发生素,属于刺猬蛋白（HH）家族。Shh信号与各种靶组织和器官的细胞存活、增殖和分化有关。作为一种血管生成因子,Shh可在生理和病理条件下诱导血管生成。此外,Shh还可以通过调控KLF4促进PDGF-BB诱导的VSMCs表型转化。因此,我们推测Pax9可能通过Shh调节VSMCs的去分化、增殖和迁移,从而调控AS。本研究旨在探讨Pax9在动脉粥样硬化性VSMCs去分化、增殖和迁移中的作用及其潜在的分子机制。方法:第一部分:将24只6周龄体重在16-18g的Apo E-/-雄性小鼠随机等分成2组,对照组和模型组,分别喂食普通饲料和高脂饲料。每周为小鼠称量一次体重,共喂养12周。实验结束后,用摘除单侧眼球方法取外周血,检测血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。接着处死全部小鼠并留取胸主动脉和腹主动脉标本,H&E染色观察血管狭窄程度、血管斑块情况和血管壁厚度。最后通过免疫荧光染色和Western blot检测Pax9在正常主动脉和动脉粥样硬化性主动脉中的差异表达情况。第二部分:首先选用PDGF-BB作为HASMC去分化、增殖和迁移的诱导因素,利用5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml和20ng/ml四种浓度处理HASMC 24h,通过CCK8检测细胞增殖活力,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架改变,通过Transwell实验检测细胞迁移能力,通过Western Blot检测Pax9、收缩表型标志蛋白α-SMA和SM22α、增殖标志蛋白PCNA以及迁移相关蛋白MMP2和MMP9的表达情况。接着,分别使用Control siRNA和Pax9 si RNA片段对HASMC进行RNA干扰,并将HASMC分为四组:Control si RNA组;Control siRNA+20ng/ml PDGF-BB组;Pax9 siRNA组;Pax9 siRNA+20ng/ml PDGF-BB组。利用CCK8、鬼笔环肽染色和Transwell实验检测HASMC的增殖和迁移能力改变,通过Western Blot检测Pax9敲减效率及HASMC去分化、增殖和迁移相关指标变化。进一步,使用过表达Flag-Pax9质粒在HASMC中过表达Pax9,并将HASMC分成四组:空载质粒组;空载质粒+20ng/ml PDGF-BB组;Flag-Pax9组;Flag-Pax9+20ng/ml PDGF-BB组。利用CCK8、鬼笔环肽染色和Transwell实验检测HASMC的增殖和迁移能力改变,通过Western Blot检测Flag过表达水平及HASMC去分化、增殖和迁移相关指标变化。第三部分:首先利用5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml和20ng/ml四种浓度的PDGF-BB处理HASMC 24h,通过Western Blot检测Shh表达水平变化。然后,分别用Shh信号通路激动剂SAG（100nM,24h）和Shh信号通路抑制剂环巴胺（5uM,2h）预处理HASMC后,使用20ng/ml PDGF-BB刺激HASMC 24h,通过CCK8、鬼笔环肽染色和Transwell实验检测HASMC的增殖和迁移能力改变,通过Western Blot检测HASMC去分化、增殖和迁移相关指标变化。接着,Western Blot检测敲减Pax9和过表达Pax9对PDGF-BB诱导HASMC中Shh表达水平影响。进一步,使用Shh信号通路激动剂SAG处理敲减Pax9的HASMC,并将HASMC分成六组:Control siRNA组;Control siRNA+20ng/ml PDGF-BB组;Pax9 siRNA组;Pax9 siRNA+20ng/ml PDGF-BB组;Pax9 siRNA+SAG组;Pax9 siRNA+SAG+20ng/ml PDGF-BB组。通过CCK8、鬼笔环肽染色和Transwell实验检测HASMC的增殖和迁移能力改变,通过Western Blot检测Pax9、Shh及HASMC去分化、增殖和迁移相关指标变化情况。最后,使用Shh信号通路抑制剂环巴胺处理过表达Pax9的HASMC,并将HASMC分成六组:空载质粒组;空载质粒+20ng/ml PDGF-BB组;Flag-Pax9组;Flag-Pax9+20ng/ml PDGF-BB组;Flag-Pax9+环巴胺组;Flag-Pax9+环巴胺+20ng/ml PDGF-BB组。通过CCK8、鬼笔环肽染色和Transwell实验检测HASMC的增殖和迁移能力改变,通过Western Blot检测Flag、Shh及HASMC去分化、增殖和迁移相关指标变化情况。结果:第一部分:1,喂养12周后对照组和模型组Apo E-/-小鼠体重均较实验前显著增加（P<0.001）,与对照组相比,模型组小鼠体重较实验初增加更明显（P<0.001）。2,模型组Apo E-/-小鼠血清TG、TC和LDL-C水平显著高于对照组小鼠（P<0.001）;模型组Apo E-/-小鼠HDL-C水平显著低于对照组小鼠（P<0.001）。3,H&E染色结果显示对照组Apo E-/-小鼠胸主动脉切片可见内膜完整,无泡沫细胞的形成和积聚,未见AS病变的形成;模型组可见血管壁增厚,内膜完整性被破坏,内膜下可见泡沫细胞形成和聚集,形成明显的动脉粥样斑块。模型组血管壁厚度相比于对照组显著增加（P<0.001）。4,免疫荧光染色显示模型组Apo E-/-小鼠中荧光标记的Pax9明显高于对照组,且主要分布在动脉中膜。5,Western blot结果显示模型组小鼠粥样硬化性主动脉组织中Pax9蛋白表达水平显著高于对照组小鼠正常主动脉组织（P<0.01）。第二部分:1,随着PDGF-BB干预浓度的增加,HASMC增殖活力逐渐上升,细胞骨架中微丝由不规则分布向均匀紧密分布重构,迁移能力逐渐增强。并且,随着PDGF-BB干预浓度的增加,HASMC收缩表型标志蛋白α-SMA和SM22α表达逐渐降低,增殖标志蛋白PCNA表达逐渐升高,迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达逐渐升高,于此同时,Pax9表达逐渐升高且呈现明显的量-效关系。2,HASMC中敲减Pax9显著抑制PDGF-BB诱导的HASMC增殖活力上升,细胞骨架重构和迁移能力增强。并且,敲减Pax9使PDGF-BB诱导的细胞α-SMA和SM22α的表达回升,而明显抑制PDGF-BB诱导的细胞PCNA、MMP2和MMP9的表达。3,HASMC中过表达Pax9显著促进PDGF-BB诱导的HASMC增殖活力的升高,细胞骨架重构和迁移能力增强。并且,过表达Pax9使PDGF-BB诱导的细胞α-SMA和SM22α表达进一步降低,而明显促进PDGF-BB诱导的细胞PCNA、MMP2和MMP9的表达。第三部分:1,随着PDGF-BB干预浓度的增加,Shh表达逐渐升高且呈现明显的量-效关系。2,使用Shh信号通路激动剂SAG预处理HASMC后给予PDGF-BB刺激,显著促进PDGF-BB诱导的细胞增殖活力上升,细胞骨架重构和迁移能力增强。同时,PDGF-BB诱导的细胞α-SMA和SM22α的表达降低更为明显,PCNA、MMP2和MMP9的表达升高也更为明显。3,使用Shh信号通路抑制剂环巴胺预处理HASMC后给予PDGF-BB刺激,显著抑制PDGF-BB诱导的细胞增殖活力上升,细胞骨架重构和迁移能力增强。同时,PDGF-BB诱导的细胞α-SMA和SM22α的表达回升,PCNA、MMP2和MMP9的表达降低。4,敲减Pax9降低PDGF-BB诱导的HASMC中Shh的表达。过表达Pax9升高PDGF-BB诱导的HASMC中Shh的表达。5,给予SAG显著逆转敲减Pax9对PDGF-BB诱导的HASMC细胞增殖活力,细胞骨架和迁移能力的影响。SAG明显逆转敲减Pax9对PDGF-BB诱导的HASMC去分化、增殖和迁移指标表达的影响。6,给予环巴胺显著削弱过表达Pax9对PDGF-BB诱导的HASMC细胞增殖活力,细胞骨架和迁移能力的影响。环巴胺明显削弱过表达Pax9对PDGF-BB诱导的HASMC去分化、增殖和迁移指标表达的影响。结论:第一部分:1,高脂饲料喂养Apo E-/-小鼠12周成功建立AS动物模型。2,AS的Apo E-/-小鼠主动脉组织中Pax9表达增加,且主要分布于动脉中膜。第二部分:1,Pax9促进PDGF-BB诱导的VSMCs去分化和细胞骨架重构,降低收缩表型标志蛋白α-SMA和SM22α的表达。2,Pax9促进PDGF-BB诱导的VSMCs增殖,升高增殖标志蛋白PCNA的表达。3,Pax9促进PDGF-BB诱导的VSMCs迁移,升高迁移相关蛋白MMP2和MMP9的表达。第三部分:1,Pax9可以通过增加Shh的表达,促进PDGF-BB诱导的VSMCs去分化、增殖和迁移。2,Shh信号通路激动剂SAG逆转敲减Pax9对PDGF-BB诱导的VSMCs去分化、增殖和迁移的影响。3,Shh信号通路拮抗剂环巴胺削弱过表达Pax9对PDGF-BB诱导的VSMCs去分化、增殖和迁移的影响。