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哺乳动物FOXL2(forkhead transcription factor gene2)在卵巢分化和卵巢功能维持上具有重要的作用。FOXL2是鸡卵巢分化的重要候选基因,但目前其功能还不清楚。为了探讨FOXL2在鸡性腺分化过程中的功能,本研究通过构建FOXL2慢病毒过表达载体并在DF1细胞系验证其功能;通过胚盘下腔注射鸡胚,探讨FOXL2对鸡胚性腺分化的影响;通过睾丸注射,探讨FOXL2对成年鸡性腺功能维持的影响。本研究得出如下结果: (1)成功克隆了广西麻鸡FOXL2基因CDS全长序列,共918bp,将测序结果与GenBank上鸡参考序列(NM_001012612.1)相比,同源性99.7%,存在三处碱基突变,分别是T226C,C501T和T690C。物种间同源性比较结果显示,广西麻鸡FOXL2基因CDS区序列与猪,鼠和人的同源性分别为80.5%,80.3%和80.1%。进化树分析显示,广西麻鸡与人的亲缘关系最远,与鼠的亲缘关系最近。 (2)用BamHⅠ和EcoRⅠ同时双酶切pMD-FOXL2克隆质粒和pLV慢病毒空质粒,然后连接转化到Trans5α感受态细胞中,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定,成功获得了pLV-FOXL2慢病毒过表达质粒。利用脂质体转染法,将pLV-FOXL2重组质粒转入鸡DF1细胞系,在倒置荧光显微镜下,观察到转染pLV-FOXL2重组质粒后,DF1能检测到绿色荧光蛋白的表达,说明构建的pLV-FOXL2慢病毒过表达质粒具有表达活性。QRT-PCR检测其FOXL2的过表达效率,结果表明FOXL2的过表达效率与对照差异极显著。 (3)将pLV-FOXL2质粒和pLV空质粒与脂质体混合,制作质粒-脂质体复合物,通过胚盘下腔注射法将复合物注入孵化到第2天的鸡胚,孵化到16.5天,在体视显微镜下观察性腺的表型变化,收集性腺组织用作后续的实时荧光定量(qPCR),组织切片和免疫组化分析,采集肌肉组织分别用于遗传性别鉴定和阳性个体鉴定。结果显示,pLV-FOXL2组共注射260枚,存活41枚,存活率为15.8%,其中遗传性别为公的23只,遗传性别为母的18只,表型性别为公的21只,表型性别为母的18只,其中有2只的表型性别不典型,左侧性腺膨大变黄类似卵巢结构。pLV组共注射100枚,存活21枚,存活率为21.0%,遗传性别为公的9只,遗传性别为母的12只,表型性别与遗传性别一致。阳性个体鉴定结果示显,pLV-FOXL2组有10只可检测到GFP,阳性率为24.4%;pLV组有8只可检测到GFP,阳性率为38.1%。 (4)鸡胚性腺HE染色的结果显示,pLV-FOXL2组和pLV组公鸡睾丸的组织结构相似,与正常母鸡卵巢结构不同。免疫组化的结果显示CYP19A1蛋白在pLV-FOXL2组左右侧睾丸中的表达量与pLV组左右侧睾丸和正常母鸡卵巢相当;FOXL2蛋白在pLV-FOXL2组左右侧睾丸中的表达量高于pLV组左右睾丸,与正常母鸡卵巢中的表达相似。性别相关基因的qPCR结果显示,在pLV-FOXL2组中,AMH和CYP19A1的表达量显著下调(P<0.05),而SOX9的表达量显著上调(P<0.05)。本试验说明,胚胎期FOXL2可能通过下调AMH抑制睾丸发育,使曲精细管壁变厚,结缔组织增生。 (5)将pLV-FOXL2和pLV质粒-脂质体复合物,通过睾丸直接注射法从左侧睾丸注入13周龄公鸡睾丸中,20天后,观察公鸡鸡冠颜色,检测两侧睾丸的解剖学结构,组织学结构,免疫组化和性别相关基因的相对表达情况。结果显示,与pLV组相比,pLV-FOXL2组公鸡鸡冠的颜色明显变白;pLV-FOXL2组左右测睾丸曲精细管变小,曲精管上皮变厚,精子生成出现障碍;免疫组化的结果显示,与pLV组比,pLV-FOXL2组睾丸FOXL2和CYP19A1的表达量增加;性别相关基因的表达结果示显,在pLV-FOXL2组中,FOXL2和CYP19A1基因的表达量均显著高于pLV组(P<0.05)。本试验说明,FOXL2可通过调控CYP19A1的表达来维持睾丸的功能。 本研究的结果提示,FOXL2可通调节AMH和CYP19A1基因的表达调节鸡胚性腺的发育,与CYP19A1协同作用维持成年性腺的功能。