【目的】前期研究发现,白花前胡甲素对大鼠脑缺血再灌注具有保护作用。而脑缺血再灌注后脑神经元损伤表现为细胞坏死和细胞凋亡。其中细胞凋亡受多种基因表达调节,如:Caspase家族和Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调控基因。本实验通过白花前胡甲素对大鼠脑缺血再灌注后检测对Bcl-2/Bax、caspase9、caspase3的影响,探讨白花前胡甲素是否可通过抑制细胞凋亡从而保护缺血再灌注所致脑组织损伤。【方法】购买96只SPF级健康SD雄性大鼠,体重240-260g,实验大鼠均由厦门大学动物实验中心够得,许可证号码SCXK(沪)2012-0002。采取随机方法分为8组,12只一组,分为正常组(10ml/kg溶剂腹腔注射给药),假手术组(10ml/kg溶剂腹腔注射给药),生理盐水组(MCAO造模后,生理盐水10ml/kg腹腔注射给药),溶剂对照组(MCAO造模后,10ml/kg溶剂腹腔注射给药),尼莫地平组(MCAO造模后,1mg/kg尼莫地平腹腔注射给药),白花前胡甲素低剂量组(MCAO造模后,Pd-Ia1mg/kg腹腔注射给药),白花前胡甲素中剂量组(MCAO造模后,Pd-Ia5mg/kg腹腔注射给药),白花前胡甲素高剂量组(MCAO造模后,Pd-Ia10mg/kg腹腔注射给药)。实验用大鼠采用线栓方法来制造大脑中动脉缺血阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)的大鼠脑缺血模型。在每组随机选择4只,采用MCAO法造出脑卒中动物模型,造模成功后,在缺血3h后开放灌注同时,再灌注后6h,再灌注后12h、再灌注后24h,再灌注后48h给药,再灌注后72h给药(共6次给药),然后处死、断头取脑、切片,进行ttc染色。再从8组中每组随机再取4只,采用mcao法进行造模,造模成功后,在缺血3h后开放灌注同时,再灌注后6h,再灌注后12h、再灌注后24h给药,共给药4次,然后处死、断头取脑、固定、脱水、石蜡包埋等再进行免疫组化检测及tunel法检测细胞凋亡。接着再从8组中每组随机再取4只,采用mcao法进行造模,造模成功后,在缺血3h后开放灌注同时,再灌注后6h,再灌注后12h、再灌注后24h给药,共给药4次,然后处死、断头、取大脑皮质进行wb和rt-pcr。所有结果都已均数±标准差(x±s)表示,用spss22.0统计软件对获得的数据进行统计分析,组间差异性采用单因素方差分析,p<0.05为有差异性;如果非正态分布,采用非参数检验,p<0.05为有差异性。【结果】1.从行为学上看,经过mcao造模后的大鼠评分在1分、2分、3分之间,造模成功体现在假手术组和正常组没有神经功能损伤,其生物行为学评分为0分。对mcao造模后的大鼠在缺血3h再灌注前(即给药前)时评分和缺血再灌注24h后进行评分对比。对于pd-ia实验各剂量组,缺血再灌注24h后的评分比苏醒时降低,p<0.01,存在差异显著性。于缺血再灌注24h后评分,把pd-ia实验各剂量组与生理盐水组比较,发现pd-ia实验各剂量组的评分低于生理盐水组。pd-ia1mg/kg组与生理盐水组比较,p<0.01,存在差异显著性。2.从tunel染色上可见脑缺血再灌注后脑缺血区有凋亡细胞存在,使用白花前胡甲素后,凋亡细胞的数量减少。其中,以Pd-Ia 5mg/kg组凋亡减少最为显著;3.免疫组化结果显示,脑缺血再灌注后24小时,Bcl-2表达,使用白花前胡甲素后Bcl-2表达显著升高。白花前胡甲素的三个不同剂量实验组与生理盐水组、溶剂组、尼莫地平组、以及白花前胡甲素的三个不同剂量组相互比较,差异均极显著性。其中以Pd-Ia 5mg/kg组可极显著的促进Bcl-2表达;免疫组化检测活化型的Caspase3的表达可见,脑缺血再灌注后Caspase3被明显激活,使用白花前胡甲素后Caspase3的活化型与生理盐水组、溶剂组、尼莫地平组以及白花前胡甲素三个不同剂量实验组之间比较,均可显著降低。其中,以Pd-Ia 5mg/kg组的抑制效应最明显。4.免疫印迹检测发现,白花前胡甲素Pd-Ia 5mg/kg组可显著抑制Caspase3,Caspase9的活化。与生理盐水组相比较,p<0.01,存在差异显著性。而Bcl-2/Bax比值,白花前胡甲素实验各组与生理盐水组比较,比值有增高,p<0.01,存在差异显著性;5.PCR实验的Bcl-2/Bax比值发现,白花前胡甲素实验各剂量组与生理盐水组比较,有显著上升,p<0.01,存在差异显著性。【结论】1.白花前胡甲素能够改善MCAO后动物行为学变化,减小梗死体积,抑制细胞凋亡。2.白花前胡甲素可以通过上调Bcl-2/Bax表达的比值和抑制凋亡启动酶Caspase9和执行酶Caspase3的表达来抑制细胞凋亡,从而发挥其保护脑缺血再灌注损伤的作用。3.在白花前胡甲素三个剂量组中以Pd-Ia 5mg/kg组的效果最佳。