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研究背景 近年来,结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势,死亡率居各类传染病之首,严重威胁着世界人口中相当大一部分人的生命。针对全球结核病疫情恶化的现状 , 世界卫生组织(WHO) 和世界上许多国家都重新制订了结核病的控制规范和标准的治疗方案 ,在世界卫生组织推荐的标准抗结核治疗措施中异烟肼和利福平仍然是不可替代的一线抗结核药物。然而结核病又好发于爱滋病、器官移植及年老体弱等机体免疫力低下的患者,并且常常合并其它感染或合并其它疾病。因此异烟肼和利福平就不可避免的与治疗其它感染或其它疾病的药物同时应用,这些药物大都经过肝脏细胞色素P450酶(CYP450)代谢灭活,而异烟肼和利福平都对CYP450酶活性有一定影响,因此异烟肼和利福平与上述药物合用可能会通过影响CYP450的活性而引起这些药物代谢变化,造成体内蓄积,并引起药效变化或出现不良反应,导致治疗失败或毒副作用。目前文献报道,异烟肼是CYP450多种同功酶的抑制剂,而利福平是CYP450多种同功酶的诱导剂,然而这些结论大都是通过整体动物和动物肝细胞实验得出的,动物和人存在着种属差异性,其结果仅能作为参考。更值得指出的是,迄今为止,尚无异烟肼和利福平联合用药对CYP450酶影响的报告。异烟肼和利福平在抗结核治疗中通常是联合应用的,因此明确异烟肼和利福平联合应用对CYP450酶活性的影响对调整合并用药的和种类剂量,防止疗效降低或不良事件的发生具有极其重要的意义。由于研究方法的局限性与医学伦理学的严格规定,目前还没有在人体上进行异烟肼和利福平单药或联合应用对CYP450酶的活性的研究。与此同时,在异烟肼和利福平联合应用抗结核的治疗中,药物性肝炎的发病率较高,不少患者由于肝功能损害被迫选用二线抗结核药或中断治疗,甚至因肝功能衰竭死亡。因此明确异烟肼和利福平单用和联合应用的肝毒性在制定合理的抗结核治疗方案中具有十分重要的指导意义。然而目前在人体进行抗结核药的肝毒性研究主要是流行病学的随访,这种研究方法在研究对象上存在着不少混杂因素,由于患者年龄、性别、地域、病情严重程度、伴发症及对药物的胃肠道吸收和生物利用度的差异,影响了组间的可比性,而且难以进行绝对单药的研究。其次大量动物 实验的肝毒性研究,由于种属差异性的原因,与人体的差异是不言而喻的。目前文献报道,人原代肝细胞是最接近在体肝脏的研究药物肝代谢及肝毒性的<WP=5>研究体系,其评价药物肝代谢及肝毒性的研究结果与临床情况比较一致。因此我们采用了健康成人肝脏细胞为研究体系,在细胞水平评价异烟肼和利福平单用及联合应用对CYP450活性影响和肝毒性,为合理制定抗结核治疗方案提供实验依据。研究目的:(1)明确异烟肼和利福平单用和联合应用对CYP450酶同工酶1A2和3A4活性的影响。(2)观察异烟肼和利福平单用和联合应用对CYP450酶同工酶1A2mRNA和3A4mRNA表达的影响,探讨上述药物对1A2和3A4活性影响的机制。(3)明确异烟肼和利福平单用和联合应用的肝细胞毒性。研究方法:第一部分:从健康成人肝脏或肝叶中分离出肝细胞,原代培养3天。分别与异烟肼( 25uM 、 50uM )、利福平(12.5uM、 25uM )和两药联合应用(1A2:利福平12.5uM &异烟肼50uM、 利福平25 μM&异烟肼50 μM ;3A4:利福平12.5 uM &异烟肼25 uM、利福平25 uM &异烟肼25 uM、利福平25 uM &异烟肼50 uM)共孵2天,再加入CYP450酶同工酶1A2和3A4的相应底物(非那西丁和 睾酮 ),反应终止后用高效液相仪测量代谢产物对乙酰氨基酚和 6?-羟基睾酮的生成量,评价异烟肼和利福平单用和联合应用对CYP450酶同工酶1A2和3A4活性的影响。第二部分:从健康成人肝脏或肝叶中分离出肝细胞,原代培养3天。分别与异烟肼、利福平和两药联合应用共孵2天,药物浓度同第一部分。然后用Trizol 抽提mRNA, 通过逆转录合成cDNA,扩增逆转录合成的cDNA ,测定CYP450酶同工酶1A2和3A4mRNA的表达强度,观察异烟肼和利福平单用和两药联合应用对CYP450酶同工酶1A2和3A4mRNA表达的影响。第三部分:从健康成人肝脏或肝叶中分离出肝细胞,与异烟肼(5uM、10uM、 25uM、 50uM)、利福平(5uM、10uM、 25uM、 50uM)和两药联合应用(R5uM&I5uM,R10uM&I10uM&,R25uM&I25uM,R50uM&I50uM)共同孵育24小时后,用自动生化分析仪检测细胞培养液中ALT和AST的活性,评价异烟肼和利福平单用和联合应用的肝细胞毒性。研究结果:第一部分:临床血药峰浓度范围内的异烟肼和肝细胞共孵2天, CYP450酶1A2的活性均低于阴性对照组(P<0.01),但未低于50%。用临床血药峰浓度范围内的利福平和肝细胞共孵2天,12.5uM浓度组CYP450酶1A2的活性高于阴性<WP=6>对照组(P<0.05),但未达到2倍,25uM浓度与阴性对照组比较无统计学差异(P>0.05)。用临床血药范围内的异烟肼和利福平两个浓度配伍与肝细胞共孵2天,肝细胞CYP450酶1A2的活性均低于阴性对照组(P<0.05),但未低于阴性对照的50%。临床血药峰浓度范围内的异烟肼和肝细胞共孵2天,肝细胞CYP450酶3A4的活性均小于阴性对照组的50%。用临床血药峰浓度范围内的利福平和肝细胞共孵2天,CYP450酶3A4的活性与阴性对照组比较均有统计学差异(P<0.01) , 其中12.5 uM浓度组CYP3A4的活性是阴性对照组的