论文部分内容阅读
研究背景和目的:肾脏系膜是肾小球毛细血管袢之间重要的支持成分,由系膜细胞和系膜基质组成。系膜细胞对保持毛细血管袢的开放并维持有效的。肾脏灌注和滤过有重要意义。系膜细胞的损伤可见于各种临床肾脏疾病,并将会导致一系列病理变化,最终导致肾功能的衰竭。近年的研究显示骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有跨系分化成非造血细胞的能力,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经元及星形胶质细胞等。而既往研究表明,骨髓来源的细胞可以补充肾小球系膜细胞,骨髓间充质干细胞在体内和体外均有分化成为肾小球系膜细胞的潜能,从而成为肾损伤组织修复的细胞来源。在肾小球毛细血管袢发育过程中,许多生长因子与细胞因子参与其中并发挥重要作用。其中血小板源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）与系膜细胞的发育有确切相关证据,PDGFB-/-或PDGF受体（platelet-derivedgrowth factor receptor,PDGFR）β-/-动物模型中,肾小球毛细血管袢不发育,且缺乏系膜细胞。提示PDGFB/PDGFRβ对系膜细胞的招募具有重要意义。目前尚未见到BMSCs向。肾脏系膜细胞分化机制研究的相关报道,推测可能是通过干细胞表面的PDGFR的介导,激活细胞内各种信号转导途径及分子,产生定向诱导分化作用。本研究选用的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/external-signal regulated kinase,MAPK/ERK）途径参与了胚胎发育、细胞分化、转化和增殖的过程。且据目前资料显示此信号转导途径介导了BMSCs向其他种类细胞的定向诱导分化。本研究旨在证实PDGF-BB体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肾脏系膜细胞分化的潜能,并初步探讨MAPK/ERK途径在此诱导分化过程中发挥的作用。实验方法:1、利用贴壁法获取SD大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养增殖,用以PDGF-BB为主的培养体系对骨髓间充质干细胞进行诱导分化,观察诱导分化细胞的生长情况,并对其进行形态学、系膜细胞高表达分子的检测以及功能学鉴定。2、在此诱导分化体系中,加入ERK活化阻断剂PD98059,观察细胞形态变化及其系膜细胞高表达分子mRNA的表达情况。研究结果:1、在PDGF-BB 7天的诱导分化作用下,约10%骨髓间充质干细胞（占原始骨髓有核细胞0.1～0.5%）的细胞保持粘附在Ⅳ型胶原包被的培养皿底,分化为多角形的系膜细胞样细胞,而对照组细胞仍保持长梭形漩涡状干细胞外观。诱导分化组细胞的系膜细胞高表达分子α-Actin及Desmin免疫荧光染色呈阳性,诱导分化组及对照组细胞的Ⅷ因子免疫荧光染色均呈阴性。培养7天的诱导分化组细胞α-Actin、Desmin、Thy-1、Myosin及Vimentin mRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.05）,诱导分化的细胞具备对血管紧张素Ⅱ刺激产生收缩反应的功能。2、经PDGF-BB诱导分化7天的细胞,其PDGF受体（包括PDGFRα及PDGFRβ）mRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。在此诱导分化体系中,加入MAPK/ERK1/2活化阻断剂的细胞,保持了长梭形的干细胞外观,阻断了大部分的系膜细胞高表达分子（α-Actin、Desmin、Thy-1及Myosin）mRNA的上调表达,而对于Vimentin mRNA表达的影响不显著。研究结论:大鼠骨髓间充质干细胞经PDGF-BB为主的诱导分化体系诱导后,可以分化为肾脏系膜细胞样细胞,MAPK/ERK1/2介导的细胞内信号转导途径在此诱导分化机制中发挥了重要作用。