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卵巢恶性肿瘤是严重威胁妇女健康的重大疾病，由于70％以上的患者就诊时已属晚期，传统的手术、化疗和放疗常常难以治愈，而且60％以上的患者最终将复发。近年来，以免疫治疗为代表的生物治疗日益受到重视。 肿瘤的形成与肿瘤抗原的免疫逃逸有关，而晚期肿瘤患者常常处于免疫耐受和免疫抑制状态。免疫治疗的主要目的在于逆转肿瘤抗原的免疫逃逸，或是打破免疫耐受和免疫抑制状态。为此，寻找一种用于了解荷瘤机体免疫状态的指标具有重要的意义，它不仅可以反映机体所处的免疫状态，也可以在一定程度上预测着疾病的预后。 辅助性T细胞(help T，Th)亚群及其所分泌的细胞因子的研究为了解卵巢恶性肿瘤患者的免疫状态，以及寻找免疫治疗方法提供了新的思路。根据分泌的细胞因子的不同，Th细胞可以分为Th1和Th2两个亚群。其中Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等Ⅰ类细胞因子，调节细胞免疫，在抗肿瘤免疫中起重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等Ⅱ类细胞因子，调节体液免疫，也参与肿瘤的免疫抑制的发生。这两类细胞因子的分泌具有相互制约的作用，同时又受到其相应转录因子的调控。研究表明，非小细胞肺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌等诸多肿瘤都高表达Ⅱ类细胞因子、低表达Ⅰ类细胞因子，即表现为Th2优势状态，它是肿瘤患者的免疫逃逸发生的原因之一。因此，监测Th1／Th2细胞因子的表达可以反映机体的免疫状态；而逆转Th2的优势表达，则可能达到免疫治疗的目的。 目前，国内外对卵巢恶性肿瘤与此相关的研究报道较少，尤其是对于转录因子水平的研究尚未见报道。因此，本研究以卵巢恶性肿瘤为对象，检测其Th1／Th2两类细胞因子及其相应的转录因子T-bet／GATA3的表达状况，并进一步运用中药安徽医科大学硕士学位论文川芍嗦对卵巢恶性肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuelear eells，PBMCS)进行调节，以期寻找卵巢恶性肿瘤免疫监测及免疫治疗的新途径。目的1.建立并优化细胞内细胞因子和转录因子mRNA的检测方法。2.检测卵巢恶性肿瘤患者Thl/Th2细胞因子及其相应转录因子的表达状况。3.探讨川芍嚓在体外对卵巢恶性肿瘤患者ThZ优势状态的逆转作用。方法1.建立RT’- PCR检测细胞因子和转录因子的方法 贴壁培养卵巢癌细胞株HO一8910;FicoU分离外周血单个核细胞;异硫氰酸肌一步法提取总RNA。RT反应条件为:37OC、lh;70℃灭活巧min。PCR体系反应条件:94℃变性455，58OC退火455，72℃延伸，进行30个循环。1%的琼脂糖，加样PeR产物总量为8林l，goV电流1 ooA电泳20min。对引物、Taq酶、MgCI:的终浓度进行梯度试验，扩增产物进行凝胶电泳，分析结果，选择最优体系。运用优化后的PCR体系，检测卵巢恶性肿瘤患者PBMCs细胞因子和转录因子的表达。2.卵巢恶性肿瘤患者免疫状态的研究 研究组为44例卵巢恶性肿瘤患者，对照组为10名健康女性，分离PBMCS，提取总RNA，R卜PCR扩增目的基因，产物进行凝胶电泳。以p一actin为内参照，半定量分析各细胞因子和转录因子的表达强度。所有结果运用确切概率法、t检验和直线相关分析进行统计处理。3.川芍嗦逆转卵巢恶性肿瘤免疫逃逸状态的体外研究 20例卵巢恶性肿瘤患者，分离其PBMCs;并以细胞浓度2 X 106/ml进行体外培养;按100协g/ml加入川芍嗦，37oC、5%CO:培养48h，RFPCR方法检测川芍嗦 一4-安徽医科大学硕士学位论文作用前后细胞因子和转录因子的表达水平，半定量分析各因子的表达强度。4荧光定量PCR方法的建立及初步运用 卵巢癌细胞株HO一8910培养;卵巢恶性肿瘤患者PBMCs分离;提取总RNA后进行RT反应。以染料SYBR Greenl作为荧光标记进行荧光定量PCR反应;在55一95 OC的区间内绘制荧光定量PCR产物溶解曲线;各因子定量以Ct值为标准，与本组的内参照p一actin的Ct值比较，获得细胞因子和转录因子的基因丰度比。凝胶电泳对荧光定量PCR产物进行检验。结果1.RT-PCR检测方法的建立 人p一actin经RT-PCR的扩增可以获得满意的目的条带，PcR条件经优化后，目的条带更清晰，30个循环时不出平台现象，对卵巢恶性肿瘤患者PBMCs细胞因子的初步检测，H类细胞因子IL一4和IL一10为阳性，表达强度分别为0.87和0.24;I类细胞因子IL一2和INF一Y为阳性，表达强度为0.巧和0.25。GAE入3和T-bet均呈阳性表达，强度分别为0.71和0.232.卵巢恶性肿瘤患者免疫状态的研究 10例健康女性仅1例低表达IFN一Y和IL一2，且表达强度较弱，其余均不表达上述各种细胞因子。卵巢恶性肿瘤患者细胞因子的表达状况:IFN一Y、IL一2、IL一4和IL一10的表达频率依次为6/44、7/44、21/44和17/44;表达强度依次为0.12、0.14、0.39、0.40和0.38。其中，IL一4和IL一10在I期/11期卵巢恶性肿瘤的表达比率为16.7%和22.2%，在111期/W期的表达比率为69.2%和50，0%。ThZ类因子的表达比率差异有显著意义(p<0.05) 健康女性T-bet/GATA3的表达频?