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背景:急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)也称为爆发性肝衰竭或爆发性肝炎,是一种罕见但高致死率的疾病。ALF是一个复杂的累及多器官功能的过程,随着病程的发展,可出现脑水肿、肾功能衰竭、呼吸功能衰竭、血流动力学障碍及凝血障碍。当发生严重的肝功能障碍时,除了对相关并发症的支持治疗及护理,肝移植仍是治疗急性肝衰竭的最终手段,但是因为移植条件的限制,只有不到10%的肝移植患者因为急性肝衰竭得到移植治疗。因此迫切需要探寻治疗急性肝衰竭的新方法。肝脏是机体最大的实质器官,其中富含免疫细胞,肝脏局部的免疫状态需要进行非常精细的调节来达到自身的免疫稳态,而急性肝衰竭形成的一个重要条件就是免疫细胞过渡活化,形成炎症风暴,攻击肝细胞而导致其凋亡、坏死,最终导致肝功能衰竭。小鼠LPS(lipopolysaccharide)/D-GalN(D-galactosamine hydrochloride)模型目前被广泛用于急性肝衰竭的机制和药物开发当中。LPS与LBP(LPS-binding protein)结合后进一步与肝脏枯否细胞(Kupffer cells)上的Toll样受体4(TLR4)结合激活免疫反应,进而产生大量的炎症因子,这其中在早期分泌的TNF-α起主导作用,其可与肝细胞表面的TNFR1结合而诱发细胞毒性作用,通过上调凋亡相关蛋白的表达而导致肝细胞凋亡异常增加。NOD1受体是模式识别受体NLRs(NOD-like receptors)家族的重要成员,其可通过感应病原菌或肠道共生菌的细胞壁成分肽降解产物二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid,DAP)来激活免疫细胞。NOD1蛋白在机体中表达非常广泛,除免疫细胞外,在各组织细胞中如上皮细胞、基质细胞、内皮细胞中均可表达。不仅肝脏免疫细胞可以表达NOD1受体,占肝脏细胞总量70%的肝实质细胞也可表达NOD1受体,并且在肝脏的免疫防御中也充当着重要的作用。因此,NOD1受体的活动与肝脏的免疫状态息息相关。由于既往尚未报道过NOD1受体在急性肝衰竭中的作用,其在急性肝衰竭中的作用机制尚不清楚。因此,探讨NOD1受体在急性肝衰竭中的调控作用及潜在机制对急性肝衰竭的防治具有重要的意义。第一部分NOD1受体激动剂预干预可减轻LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭目的:本课题主要为探索NOD1受体的预先激活对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的可能影响;预先干预NOD1受体激动剂是否可以拮抗LPS/D-GalN诱导的肝细胞死亡,同时尝试阐明其中的可能机制,从而探讨NOD1受体在肝脏中的功能及在急性肝衰竭的临床防治提供新的思路。方法:1.使用不同剂量的NOD1受体激动剂——C14-Tri-LAN-Gly,(5μg/只、10μg/只)腹腔注射预先干预小鼠6h后,LPS(7.5μg/kg)/D-GalN(500mg/kg)联合腹腔注射诱导ALF,对照组注射等体积的PBS,连续观察36小时,制作生存曲线,了解NOD1受体激动剂预干预对小鼠生存率的影响。2.使用C14-Tri-LAN-Gly腹腔注射预先干预小鼠6h后,LPS/DGalN联合腹腔注射诱导ALF,对照组注射等体积的PBS,检测血清ALT水平,肝组织H&E染色,了解NOD1预干预对LPS/D-GalN诱导的肝损伤的影响。3.对比NOD1激动剂预干预后小鼠的肝组织TUNEL染色结果,另外提取小鼠肝组织的总蛋白,通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达,以确定NOD1激动剂预干预对肝细胞凋亡的影响。4.C14-Tri-LAN-Gly预干预后6小时,再LPS/D-GalN联合注射后2小时后收集小鼠血清及肝组织,Elisa检测血清及肝组织匀浆中的TNF-α水平。分离小鼠肝脏的单个核细胞,流式细胞术检测肝脏中免疫细胞频数及其表面CD69的表达情况,使用流式细胞术检测F4/80阳性细胞上TLR4的表达是否存在差异。结果:1.两种剂量的C14-Tri-LAN-Gly预干预后,小鼠对LPS/D-GalN诱导ALF后的36小时生存曲线与对照组相比存在明显差异,提示NOD1激动剂预干预可明显改善LPS/D-GalN导致的小鼠死亡。2.LPS/D-GalN联合诱导急性肝衰竭后,C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠血清ALT水平明显降低,肝组织H&E染色提示肝脏组织坏死及炎症减少。3.C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠其肝组织TUNEL染色提示肝细胞凋亡减少,Western blot结果显示凋亡蛋白cleaved caspase-3表达下调。4.C14-Tri-LAN-Gly预干预的小鼠外周血及肝组织内TNF-α水平未见明显变化,流式细胞检测到肝组织内NK、NKT、T细胞频数及其表面CD69的表达也未变化。Kupffer细胞表面的TLR4水平并未下调。结论:NOD1受体激动剂预干预可改善LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭,并且NOD1激动剂干预后不影响TNF-α的分泌及Kupffer细胞表面TLR4的表达。第二部分NOD1受体激动剂通过上调抗凋亡分子A20的表达拮抗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭目的:1.通过NOD1激动剂干预TNF-α/D-GalN诱导的急性肝衰竭来进一步探索其保护机制。2.检测NOD1激动剂干预后肝脏抗凋亡分子的表达来探索其抗凋亡作用机制。3.进一步阐述NOD1激动剂保护LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的机制。方法:1.使用C14-Tri-LAN-Gly预干预小鼠后,观察其对TNF-α/D-GalN诱导的ALF的36小时生存曲线,检测TNF-α/D-GalN注射后6小时血清ALT水平、肝组织H&E染色、肝组织TUNEL染色和肝组织凋亡蛋白的表达。2.C14-Tri-LAN-Gly及LPS/D-GalN干预后,分离小鼠肝实质细胞,使用anti-TNFR1流式抗体标记细胞,流式细胞术检测肝实质细胞表面的TNFR1的表达情况。3.Western blot及RT-qPCR检测诱导小鼠肝组织内抗凋亡分子的表达情况。4.单独使用C14-Tri-LAN-Gly干预小鼠,Western blot及RT-qPCR检测抗凋亡分子A20的表达。5.shRNA尾静脉水动力高压注射干扰小鼠肝脏A20表达,检测干扰A20表达后肝组织损伤及细胞凋亡情况。6.提取小鼠原代肝实质细胞,使用C14-Tri-LAN-Gly体外刺激小鼠原代肝实质细胞,检测体外直接刺激肝实质细胞后A20的mRNA及蛋白水平表达变化。7.使用clodronate-liposomes尾静脉注射清除小鼠Kupffer细胞,之后注射C14-Tri-LAN-Gly诱导A20表达上调,检测清除Kupffer细胞对A20表达的影响。结果:1.C14-Tri-LAN-Gly预干预可改善TNF-α/D-GalN诱导的急性肝衰竭的小鼠生存率,可降低血清ALT水平,减少肝脏损伤,降低肝细胞的凋亡。2.小鼠肝实质细胞表面的TNFR1的表达并未因为C14-Tri-LANGly受到明显影响。3.C14-Tri-LAN-Gly预干预后小鼠肝组织抗凋亡分子A20的mRNA及蛋白水平表达均明显上调。4.使用C14-Tri-LAN-Gly单独干预小鼠,同样发现A20的蛋白及mRNA水平明显上调。5.shRNA干扰小鼠肝脏A20表达后,C14-Tri-LAN-Gly对LPS/DGalN的保护作用被废除。6.体外C14-Tri-LAN-Gly刺激原代肝实质细胞,未发现A20的mRNA或蛋白表达上调。7.Kupffer细胞清除后废除了C14-Tri-LAN-Gly诱导的小鼠肝脏A20的mRNA及蛋白表达上调。结论:NOD1受体激动剂通过上调肝细胞抗凋亡分子A20的表达拮抗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭,而这种作用是通过肝内Kupffer细胞介导的。