论文部分内容阅读
目的:动脉粥样硬化是一种高致死率,高致残率的疾病。因此深入研究其发病机制,治疗措施已成为重要的世界性课题。脂质浸润被认为是动脉粥样硬化发病的重要因素,由此引发的自噬活性改变以及免疫炎症反应近年也受到广泛关注。研究发现巨噬细胞自噬功能减弱可以引起脂质沉积增加,改变自噬状态后脂质沉积也相应发生改变。这些现象已经得到动物实验的证实。AMPK/mTOR/ULK1途径是调控细胞自噬的重要信号通路,其活性的改变参与多种疾病的进展。AMPK是调节生物能量代谢的关键分子,其活性受机体内多种因素的影响。mTOR是雷帕霉素在哺乳动物细胞内的靶分子,是一种磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶,参与调节多种细胞的生长和自噬等过程。AMPK可以通过mTOR磷酸化负性调节其活性,从而上调自噬。通过AMPK/mTOR途径改善自噬状态有可能成为AS防治的新途径。我们前期研究发现经典的抗疟疾药物青蒿素可以通过NF-кB途径改善AS;同时文献中青蒿素对肿瘤细胞作用途径也与此有关,而且部分研究还观察到自噬状态的改变参与其中。因此需要揭示影响巨噬细胞自噬的药物能否成为改善AS的治疗手段呢?具体途径如何?所以我们通过研究探讨青蒿素通过AMPK/mTOR/ULK1途径影响巨噬细胞自噬状态来减轻AS。研究方法:为了研讨在动脉粥样硬化中青蒿素对巨噬细胞自噬的影响及具体信号通路,我们设计了体内和体外研究观察相应蛋白的分布和浓度变化。通过建立动物模型观察青蒿素影响AS的具体机制。选取以C57BL6小鼠为背景的雄性ApoE-/-小鼠(8周龄)随机分为三个治疗组,进行8周的高脂喂养,同时分别给予两种浓度的青蒿素,之后取材。测定LDL水平,采用酶联免疫吸附试验检测MCP-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ,HE染色观察主动脉根(横截面)细胞形态学变化;油红O染色检测主动脉(一条,纵切)与主动脉根(横截面)中动脉粥样硬化损伤情况并统计损伤面积。免疫荧光统计主动脉根中F4/80阳性细胞。在体外实验中,我们常规培养RAW264.7巨噬细胞,设立5组进行研究。四组给予oxLDL培养,三组给予ART,其中两组分别予腺病毒沉默的AMPK及对照。ELISA检测细胞培养液中MCP-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。WB检测细胞中AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(S2448)、ULK1、p-ULK1(Ser757)、LC3II/I和P62表达。相应检测在骨髓巨噬细胞进行重复,应用AMPK抑制剂化合物C和自噬抑制剂3MA。油红O染色检测脂质的聚集。RFP-GFP荧光双染检测自噬发生。结果:在主动脉组织和上清液中,ART组MCP-1、IFN-γ、IL-6和TNF-α含量明显高于AS组,而高浓度ART的作用更为明显。AMPK沉默后后炎症因子含量增加。采用全主动脉油红O染色观察全主动脉粥样硬化情况。AS组主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉粥样斑块广泛分布和聚集。与AS组相比,ART组斑块形成的面积和分布均明显减少,oxLDL处理后,细胞内脂滴增多,ART处理后脂滴减少。但干扰AMPK后,结果不同。自噬检测:经oxLDL处理后,细胞自噬无明显变化;ART治疗组自噬体形成明显增加;AMPK干预后,自噬受到一定程度的抑制。WB检测青蒿素显著促进自噬相关蛋白LC3II的积累和p62的降解。AMPK的抑制作用阻断了青蒿素的作用。WB检测AMPK、mTOR、ULK1途径相关蛋白发现,沉默AMPK可阻断青蒿素对这些蛋白的作用。OxLDL诱导后,自噬荧光强度降低,青蒿素处理提高了黄色的自噬小体自噬荧光强度。这种现象将被AMPK沉默所阻断。结论:apoE-/-小鼠AS中,自噬相关蛋白LC3II/I表达减弱,P62表达增加,反映巨噬细胞自噬功能减弱,同时炎症因子表达增加。青蒿素可以通过活化AMPK,促进mTOR、ULK1磷酸化,增强LC3II表达并且降低P62,沉默AMPK后,这种作用也被明显减弱。同样应用自噬抑制剂或AMPK抑制剂能达到相近结果。表明青蒿素可以改善巨噬细胞自噬,有效抑制动脉粥样硬化小鼠的巨噬细胞向泡沫细胞转化,减少动脉粥样硬化斑块的形成,AMPK是mTOR、ULK1磷酸化的关键靶点。我们的研究表明青蒿素通过AMPK/mTOR/ULK1途径促进巨噬细胞自噬,减轻动脉粥样硬化病变。