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背景和目的： 潮汕地区是贲门癌(Gastric Cardia Cancer,GCA)高发区之一,研究发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染与贲门慢性炎症有关,而慢性炎症中产生的活性氧和活性氮片段(Reactive Oxygen and Nitrogen Species,RONS)以及前列腺素可以通过直接或间接的途径对DNA造成损伤。其中环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)是催化花生四烯酸生成前列腺素的关键酶。 DNA双链断裂(Double-Strand Breaks,DSBs)是最严重的DNA损伤类型。DSBs发生后,损伤位点的MRN复合物(MRE11,NBS1,RAD50)解开DNA双链,将毛细血管共济失调突变蛋白(Ataxia Telangiectasia Mutated,ATM)募集到损伤位点。通过与MRN的相互作用,ATM单体化并自动磷酸化Ser1981位点,形成pATM(Phosphorylation of ATM),pATM进一步使得组蛋白H2A家族成员X(H2 Ahistone family,member X,H2AX)的Ser139位点被磷酸化形成γ-H2AX(Phosphorylation of H2AX)焦点,γ-H2AX焦点在10-30min达到高峰,pATM在损伤后17min也可以达到高峰,所以,pATM和γ-H2AX在损伤位点的共表达对于DSBs的检测具有重要的意义。γ-H2AX焦点的形成为DNA损伤修复蛋白的募集提供了一个平台,pATM会继续磷酸化下游的p53蛋白,发挥细胞周期关卡的作用,使细胞周期停滞在特殊的阶段,为DNA修复赢得时间。但是,p53蛋白在肿瘤中很容易发生突变,导致DSBs修复失败。所以,DSBs不仅是最严重的DNA损伤类型,也是最难修复,并且是最容易引起细胞突变的损伤类型。在许多类型的肿瘤中发现了DSBs,表明DSBs与肿瘤存在着密切的关系。但是,目前,DSBs在贲门癌中的检测尚没有报道,并且在贲门癌中研究炎症介质COX-2与DSBs的关系也属首次。 本实验主要通过免疫组化Envision二步法检测γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2在贲门癌手术切除标本不同部位的表达情况,来探讨贲门癌和DSBs的关系;通过对贲门癌及周边组织进行炎症分级,探讨炎症与DSBs的关系。 材料和方法： 材料： 搜集2010-2012年间汕头大学医学院附属肿瘤医院术前无放化疗的贲门癌配对标本150例。分别在每例的癌组织、距离癌组织1-2cm处的癌旁组织、近切缘组织三个部位中,每个部位取两份样本:一份用来做石蜡切片,一份用来提取蛋白,做Western blotting。 方法： 1.HE染色 组织学分型及炎症程度的分级 2.免疫组化Envision二步法染色 检测γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2蛋白的表达情况 3.图像分析法 应用Leica IM50图像采集系统和Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对γ-H2AX、pATM、pp53染色结果进行分析,计算每张切片的阳性标记指数(Labelling Index,LI);对COX-2染色结果进行分析,测量每张切片的积分光密度(Intergral Optical Density,IOD)。 4.统计分析 应用SPSS15.0对统计结果进行分析,多个均数之间的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA),两个均数之间的比较采用T检验;不服从正态分布的数据采用非参数检验;相关性分析采用Pearson相关分析(Pearson correlation analysis),炎症和瘤变等级的分布差异采用卡方检验。显著性标准定位:P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有高度统计学意义。 5.Western blotting 检测γ-H2AX蛋白在贲门癌、癌旁和近切缘组织中的表达情况。 6.Simple同部位标记和消除抗体法 检测γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2的共表达。 结果： 1.γ-H2AX、pATM、pp53在近切缘组织(N)、癌旁组织(P)、癌组织(CA)中均有阳性表达,且表达率呈现逐渐递增的趋势:N
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