[研究背景]胃癌是严重影响我国及世界人民生命健康的恶性肿瘤。胃癌的发病原因尚不完全明确,它的发生发展是一个多因素多步骤的过程,幽门螺杆菌感染是其中的关键风险因素。有文献表明CagA在幽门螺杆菌诱导的胃癌中发挥着细菌癌蛋白的作用。在胃上皮细胞中,CagA能激活致癌基因的表达,还能通过启动子高度甲基化导致抑癌基因功能的失活,从而导致癌症发生。CagA还可以通过肿瘤相关巨噬细胞来抑制免疫微环境,来促进癌症的发展。KLF4是一个含有锌指结构的转录因子,在终末分化的胃肠粘膜上皮细胞中高表达,与肿瘤的发生发展有着密不可分的关系。还有一个位于转录激活结构域和转录抑制结构域的PEST序列,提示KLF4可能通过泛素-蛋白酶体通路降解。KLF4的半衰期短。它是公认的胃肿瘤抑制基因。泛素化蛋白酶体途径是调节细胞内蛋白质功能和降解的重要系统,主要调节细胞内一些结构异常或半衰期短的蛋白。长期以来泛素化的功能研究专注于泛素化酶系统。然而,近些年的研究表明,去泛素化酶(DUBs)也积极参与癌症中的细胞事件,我们课题组所关注的DUBs的功能是通过加工泛素基因产物,重塑多泛素链,逆转泛素添加到靶蛋白的过程。与其他酶促蛋白一样,DUBs的活性受到酶切特异性、泛素识别、连锁偏好、定位特异性、底物和/或蛋白识别的严格控制。于是本课题组前期用蛋白酶体抑制剂MG-132处理胃上皮细胞和胃癌细胞,证实CagA参与了 KLF4的蛋白酶体降解进程。去泛素化酶有多种类型,其中泛素特异性修饰酶USPs超家族是目前已知的去泛素化酶中成员最多,且结构最具多样性的一类。我们对实验室现有的几种USPs进行筛选,发现USP42显著上调了 KLF4蛋白的表达。然后我们发现随着幽门螺杆菌的感染及CagA的转染,KLF4和USP42的表达都是下降的;说明KLF4受到USP42调控是依赖于CagA的。然后用剂量依赖实验发现USP42可以提高KLF4蛋白的表达,敲低USP42则下调KLF4的表达并促进胃上皮细胞的恶性转化。那么USP42是如何参与调控KLF4的去泛素化呢?于是我们进行以下的实验。[研究方法]1.检测GES-1和胃癌细胞中USP42和KLF4mRNA表达水平。收集临床胃癌病人胃癌组织和邻近癌旁组织标本,检测临床胃癌病人组织标本中USP42和KLF4蛋白和mRNA表达情况。2.在胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞AGS里共同转染相同质量的CagA质粒和不同质量的USP42质粒,用WB来检测KLF4、USP42和CagA表达,来验证CagA下调KLF4的作用能否被USP42质粒的转染所逆转。3.在胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞AGS里共同转染相同质量的USP42质粒和不同质量的CagA质粒,用WB来检测KLF4、USP42和CagA表达,来验证USP42上调KLF4的作用能否被CagA质粒的转染所逆转。4.检测含有75对配对的胃癌组织和邻近癌旁组织组织芯片上KLF4和USP42的表达,分析KLF4和USP42表达的相关性。5.统计分析KLF4表达、USP42表达分别与疾病分期、肿瘤分级等临床指标的相关性。6.建立幽门螺杆菌慢性感染小鼠模型:用CagA阳性的幽门螺杆菌(PMSS1)和CagA阴性的幽门螺杆菌(PMSS1△CagA)对c57小鼠进行灌胃处理,在末次灌胃后6周和12周分别随机处死小鼠。(1)取小鼠胃幽门部做快速尿素酶实验,提取胃黏膜RNA做PCR鉴定;(2)取一部分组织用哥伦比亚培养基做分离培养,将培养出的细菌进行快速尿素酶实验和PCR鉴定;(3)用福尔马林固定部分组织,制作石蜡切片,做HE染色和免疫组化分析。[研究结果]1.USP42和KLF4在mRNA水平上在GES-1细胞高表达,在胃癌细胞低表达,在胃癌组织中USP42和KLF4的表达较癌旁组织低。2.WB结果显示,CagA下调了 KLF4蛋白的表达,这种下调作用在USP42质粒的作用下逆转,并且呈剂量依赖性。3.USP42上调了 KLF4蛋白的表达,这种上调作用在CagA质粒的作用下逆转,并且呈剂量依赖性。4.组织芯片结果显示,相邻的非肿瘤(NT)组织具有相对较高的USP42和KLF4表达,并且他们的表达水平之间存在着显著的正相关关系,USP42-KLF4表达异常具有临床意义。5.USP42和KLF4在胃癌组织中表达与年龄、肿瘤分级呈负相关,并在晚期肿瘤中表达下调。Ⅱ级和Ⅲ级肿瘤中USP42和KLF4表达差异有统计学意义。6.快速尿素酶实验和PCR结果显示,灌菌组小鼠胃部有幽门螺杆菌定殖。7.HE染色显示灌胃组小鼠胃黏膜观察幽门螺杆菌感染6周后导致的病理学变化,与PMSS1ΔCagA组相比,PMSS1组小鼠胃黏膜层和黏膜下层出现一定的炎性细胞浸润,黏膜下血管轻微水肿。两组小鼠胃部KLF4的表达水平都较高。8.HE染色显示灌胃组小鼠胃黏膜观察幽门螺杆菌感染12周后导致的病理学变化,与PMSS1ΔCagA组相比,PMSS1组小鼠胃黏膜层和黏膜下层出现较多的炎性细胞浸润,黏膜下小血管扩张充血明显,炎症变化明显。PMSS1ΔCagA小鼠胃黏膜仅有散在的淋巴细胞浸润,炎症变化不明显。对石蜡切片进行IHC染色,发现KLF4表达低于H.pylori感染6周时。[结论]1.H.pylori感染/CagA转染造成的USP42低表达导致了胃癌中KLF4蛋白的降解,CagA-USP42-KLF4信号通路异常在胃癌发生发展中起重要作用。2.H.pylori感染/CagA在胃癌发生中起重要作用。