杏贝止咳颗粒(XZK)由麻黄、苦杏仁、前胡、浙贝母、桔梗、木蝴蝶、百部、北沙参和甘草九味药材组成,具有清宣肺气、止咳化痰之功效。中药质量标志物是存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药功能属性相关的化学物质,作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制。目前,杏贝止咳颗粒物质基础研究相对薄弱,现行质量标准控制成分较单一,本课题采用液质联用技术阐释杏贝止咳颗粒化学成分,通过对处方各药材主要成分生源途径分析,明确杏贝止咳颗粒化学成分的来源和结构的特异性;进一步结合XZK中的大鼠入血成分研究以及小鼠氨水引咳模型,明确该复方中与镇咳活性相关的成分。综合研究结果确定杏贝止咳颗粒质量标志物,为质量标准提升提供依据。以杏贝止咳颗粒质量标志物为基础进行薄层鉴别、含量测定以及指纹图谱研究,以提升杏贝止咳颗粒质量标准,为有效控制产品质量、保证批间一致性提供技术支持。具体研究内容如下:1、杏贝止咳颗粒质量标志物的确定1.1杏贝止咳颗粒化学物质组辨识采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,对杏贝止咳颗粒的化学成分进行系统的分析,共鉴定和推测出92个化学成分,包括黄酮类21个,香豆素类20个,生物碱类36个,三萜皂苷类7个,其他类成分5个以及未知成分3个;并对主要成分进行生源途径和特异性分析,为质量标志物的筛选提供依据。1.2杏贝止咳颗粒镇咳活性相关的质量标志物的发现与确定基于杏贝止咳颗粒化学成分研究,采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析杏贝止咳颗粒入血成分,通过与空白血浆、化学成分谱进行对比分析,检测到入血成分共28个,包括18个原型成分和10个代谢产物,明确杏贝止咳颗粒发挥止咳平喘作用的可能活性成分。综合杏贝止咳颗粒化学成分谱、化学成分生源途径和特异性分析以及入血成分研究,初步筛选出17个成分进行镇咳活性研究。本实验采用小鼠氨水引咳模型对黄芩素、白杨素、贝母辛、异甘草素、木蝴蝶苷A共5个成分进行镇咳活性评价,结果表明除木蝴蝶苷A以外的4个成分均具有镇咳活性,结合课题组前期对其他12个成分镇咳作用筛选结果,最终确定1 1个成分为杏贝止咳颗粒质量标志物,包括君药麻黄中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱,君药苦杏仁中的苦杏仁苷,臣药浙贝母中贝母素甲和贝母素乙,臣药前胡中的白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡丙素,佐药木蝴蝶中的黄芩素、黄芩苷,使药甘草中的甘草酸。2、杏贝止咳颗粒质量标准提升研究2.1薄层鉴别研究..对现行标准中6个薄层鉴别方法的展开剂、供试品溶液制备等进行优化,并新建立了苦杏仁的薄层鉴别方法,对7个薄层鉴别方法进行耐用性考察,结果表明7个薄层鉴别方法耐用性和专属性良好,适用于杏贝止咳颗粒中浙贝母、前胡、甘草、木蝴蝶、麻黄、百部和苦杏仁的薄层鉴别,完善杏贝止咳颗粒薄层鉴别定性研究。2.2含量测定研究在现行标准苦杏仁苷含量控制的基础上,新增加盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、贝母素甲和贝母素乙含量控制,并利用二维超高效液相色谱技术对杏贝止咳颗粒整体质量控制进行研究。(1)采用HPLC-UV技术建立同时测定制剂中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量的分析方法,方法学考察结果良好,以10批次样品累积数据结合生产实际情况制定适宜的限度,拟纳入质量标准。(2)采用HPLC-ELSD技术建立同时测定制剂中贝母素甲和贝母素乙含量的分析方法,方法学考察结果良好,需累积更多批次数据结合生产实际情况制定适宜的限度,并进一步考虑是否纳入质量标准。(3)采用二维超高效液相色谱技术建立同时测定制剂中9个质量标志物以及木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的含量,方法学考察精密度、重复性、加样回收率等均符合分析方法要求,可行性较好,为深入研究并提升杏贝止咳颗粒整体质量标准提供参考。2.3指纹图谱研究采用HPLC-UV技术建立了杏贝止咳颗粒指纹图谱分析方法,以10批杏贝止咳颗粒的指纹图谱为参考共标定26个共有峰。结合处方药材及UPLC-Q-TOF-MS对26个共有峰进行归属和指认,结果表明该方法可用于杏贝止咳颗粒整体质量评价。对10批杏贝止咳颗粒指纹图谱进行主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析,结果表明批次之间产生差异的主要成分共5个,主要归属于制剂中百部、前胡和木蝴蝶三味药材,提示生产中需重点关注这三味药材的质量,可以更加科学、高效地控制杏贝止咳颗粒批次质量。