近年来,植物多糖因具有多途径、多靶点及多环节的特点在抗肿瘤方面的研究一直比较活跃。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)因可通过直接的杀伤肿瘤细胞或增强机体免疫活性途径发挥抗肿瘤的作用受到研究者的关注。药物抗肿瘤活性的研究离不开肿瘤模型,其中三维体外组织工程肿瘤培养系统因能更好模拟体内肿瘤微环境,逐渐成为研究肿瘤生物学及预测新型药物的重要组成部分。作为构建组织工程肿瘤基本因素之一,支架的选择尤为重要。脱细胞支架因可较好保留原细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分、生理生化及机械性能,已被广泛用于肿瘤模型的构建。本研究制备一种新型的脱细胞猪肺衍生支架并进一步构建3D肿瘤模型,从体外2D、3D培养和小鼠皮下种植瘤等多种肿瘤模型综合考察了 APS的抗乳腺癌作用及机制。同时,利用网络拓扑的生物信息学方法获得枢纽基因并实验验证APS体内抗乳腺癌的其它可能机制,以便为APS的临床应用提供更多的实验及理论依据。多糖的结构及组成与其生物活性有直接关系,本研究选用美国泛华医药的同一批次APS作为研究对象,通过紫外光谱、IR光谱、NMR及HPLC等多种方法,结果表明APS具有典型的多糖特征吸收峰,组成单元主要为α-型吡喃型糖苷键。APS不含核酸和蛋白质,主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。SEM发现APS为球形或类球形颗粒无规则地堆积在一起,多数颗粒为纳米尺度,这与其后续激活巨噬细胞并进一步发挥抗癌活性有直接的关系。以上结果表明APS纯度较高,性状良好,适合后续实验研究。多糖抗肿瘤机制主要包括直接的杀伤作用和通过提高机体免疫间接抗肿瘤两个方面。本研究首先选用传统的2D肿瘤培养模型,最初确定APS体外对乳腺癌细胞株(MCF-7和4T1)无直接的细胞毒作用后,从其提高机体免疫发挥抗肿瘤活性出发,体外考察APS介导巨噬细胞上清(Conditioned medium,CM)对MCF-7和4T1细胞的抑制效果及机制。结果表明APS介导CM可显著抑制MCF-7和4T1细胞的生长,其机制可能与APS与巨噬细胞表面Toll-样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合后激活巨噬细胞,并进一步促进肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和一氧化氮(Nitric oxide,NO)的分泌有关。APS介导CM抗乳腺癌细胞株MCF-7和4T1的活性主要通过诱导细胞周期阻滞(G1和G2期)和促进细胞凋亡实现。CM可通过调节线粒体凋亡途径进而促进MCF-7和4T1细胞的凋亡。基于3D培养模型较传统2D培养更能模拟体内肿瘤生长微环境且提高药物筛选效率和准确性,本研究进一步评估CM对3D培养MCF-7细胞的抑制作用。本章首先制备脱细胞处理后的猪肺衍生支架并进一步构建体外3D乳腺癌模型,考察MCF-7在脱细胞猪肺支架上的多种细胞行为及乳腺癌特定蛋白的表达。脱细胞猪肺衍生支架具有良好的生物相容性,MCF-7细胞可在脱细胞猪肺支架不断生长增殖形成肿瘤球。相比2D培养,3D脱细胞猪肺基质培养环境可显著提高乳腺癌细胞的恶性程度,具体表现为降低的细胞生长速率和提高的乳腺癌特定蛋白的表达。此外,3D脱细胞猪肺衍生支架显著促进肿瘤细胞的局部缺氧环境。基于此,利用脱细胞猪肺衍生支架构建的肿瘤模型对于进一步研究CM对3D乳腺癌细胞的抑制活性提供了更可靠的平台。CM给药可显著降低细胞活率,减小MCF-7所发展成的肿瘤球尺寸。CM可通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达促进3D培养MCF-7细胞的凋亡。为了评估本研究所制备新型脱细胞猪肺支架与目前常用的天然及合成材料所构建肿瘤模型的差异,本研究制备壳聚糖/明胶(Chitosan/Gelatin,Chi/Gel)及左旋聚乳酸(Poly(L-lactide),PLLA)支架,并进一步比较了 MCF-7细胞体外在2D培养及三种支架上的细胞行为、乳腺癌蛋白表达、药物敏感性及4T1细胞在2D和3D支架上的体内致瘤性及血管形成情况。结果表明3D培养显著降低了 MCF-7细胞对5-FU的敏感性及促进乳腺癌恶性程度。MCF-7细胞在2D和3D培养条件下的细胞形态具有明显差异,MCF-7细胞在三种支架均形成“葡萄串”样式堆叠的肿瘤球。PLLA支架因表面最为粗糙且孔径最小,MCF-7细胞体外在PLLA支架生长增殖最快。相反地,将接种4T1细胞的三种支架植入BALB/c小鼠皮下4周后,PLLA支架因在体内降解成乳酸引发炎症,其在体内肿瘤的发展及血管生成方面效果最差。MCF-7细胞在脱细胞猪肺衍生支架上体外生长增殖优于其在Chi/Gel支架上的,而4T1细胞在脱细胞猪肺衍生支架上体内肿瘤的发展优于其在PLLA支架上的。结果表明本实验所制备的脱细胞猪肺衍生支架较之天然和合成材料支架在体外体内肿瘤发展方面呈现出一定优势,适合用于肿瘤生物学研究。机体的免疫系统十分复杂,涉及多种免疫细胞及其分泌的细胞因子。相比较体外仅从APS激活巨噬细胞后发挥抗乳腺癌细胞活性,本研究经BALB/c小鼠皮下接种4T1细胞肿瘤造模成功后,从对小鼠的免疫器官、免疫细胞及细胞因子分泌的影响评估APS体内抗乳腺癌的作用机制。结果表明连续腹腔注射APS两周后,APS(200 mg/kg)、5-FU(20 mg/kg)及联合给药组(APS+5-FU)虽然均可显著抑制小鼠肿瘤的生长,但对免疫器官结构和功能的影响明显不同。APS可显著提高小鼠胸腺和脾脏指数,对破坏的胸腺组织及脾脏组织结构有明显的修复作用。相反地,5-FU组小鼠脾脏和胸腺指数明显下降,且对胸腺和脾脏结构的损伤程度进一步加重。同时,APS能够显著提高小鼠的脾淋巴细胞的增殖能力和提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。另外,APS能够提高小鼠外周血中IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达水平。以上结果表明APS可能通过修复免疫器官、调控细胞免疫应答和提高细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。APS联合5-FU可提高抗肿瘤效果,缓解5-FU对免疫体统的损伤,适合作为化疗的免疫辅助药物。本研究进一步基于网络拓扑生物信息学方法研究APS体内抑制肿瘤生长的其它可能机制。本研究从EMBL-EBI数据库中下载7组乳腺癌基因芯片表达谱数据,通过分析筛选出201个共同差异表达基因(Differential expressed gene,DEG),调节一致的有189个DEGs,其中上调基因73个,下调基因116个。基因本体功能注释(Gene ontology,GO)富集分析表明DEGs主要参与细胞周期、细胞增殖、染色体分离、细胞分化等生物过程。考虑到本研究前面所发现的APS介导CM抑制体外乳腺癌细胞生长的作用机制,特别对涉及细胞周期、增殖和凋亡等生物过程条目所在DEGs构建蛋白交互作用(Protein-protein interaction)网络,并对网络各个节点进行度值分析筛选枢纽基因。结果表明EGFR和ANXA1基因为枢纽基因及共同基因,文献检索结果也表明这两个基因在多数癌症中异常表达。本研究免疫组化实验结果发现APS对EGFR和ANXA1蛋白在乳腺癌组织中的表达具有反调节作用,揭示这可能是APS体内抑制乳腺癌生长其它可能的机制之一。综上所述,本研究制备了一种新型3D脱细胞猪肺衍生支架并证明其在组织工程肿瘤模型应用的可行性。在此基础上,本研究通过体外2D、3D培养、动物体内种植瘤等多种肿瘤模型表明APS体内主要通过提高机体免疫功能发挥抗乳腺癌活性,而且其可有效提高化疗药物的协同作用。体外则是激活巨噬细胞后通过促进细胞凋亡及阻滞细胞周期抑制乳腺癌细胞的生长。生物信息学分析表明APS可下调EGFR和上调ANXA1蛋白的表达,这可能是APS体内抗乳腺癌的另一机制。本研究可为临床使用APS及其协助化疗药物发挥抗乳腺癌活性提供更多实验及理论依据。