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目的: 构建基于TNF-α跨膜段(transmembrane，TM)的pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO真核表达载体。把构建好的载体瞬时转染HeLa细胞，重组载体转染细胞后能高效快速表达出更接近天然活性的EPO蛋白。用FactorXa消化重组载体表达的融合蛋白，表达在细胞膜外的rhEPO从FactorXa位点处切割下来，达到可控酶切。用透析、离子交换层析和凝胶过滤层析能快速分离纯化rhEPO，并计算它的回收率。 方法: 1.经佛波脂和脂多糖诱导HL-60细胞使其表达TNF-α的mRNA，RT-PCR扩增TNF-α跨膜段(TM) cDNA。构建pcDNA3.1-TM-FactorXa载体，转化DH5α，筛选出阳性克隆。 2.从人胎肝细胞中用Trizol法提取总RNA，RT-PCR方法扩增EPO的CDNA全序列片段。连接到T载体，PCR克隆EPO成熟肽段的cDNA。构建pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO载体。转化DH5α，筛选出阳性克隆。 3.构建好的载体pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO瞬时转染HeLa细胞。用RT-PCR、实时定量PCR、Western Blot和ELISA方法从mRNA水平和蛋白水平检测rhEPO蛋白的表达情况，验证FactorXa对融合蛋白的酶切效果。用透析、离子交换层析和过滤层析鉴定rhEPO的纯化效果。 结果: 成功用佛波脂和脂多糖诱导HL-60细胞表达TNF-α的mRNA。用Trizol提取总RNA，RT-PCR扩增到TNF-α跨膜段(TM)。在胎肝细胞中成功克隆到EPO全序列段cDNA，亚克隆得到EPO成熟肽段cDNA。成功构建了基于TNF-α跨膜段(TM)的pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO跨膜真核表达载体。重组质粒经脂质体瞬时转染，成功转染HeLa细胞并表达了目的蛋白。FactorXa能切下目的蛋白。ELISA检测到转染24h的细胞:经FactorXa酶消化总蛋白，rhEPO浓度为285.21μg/mL;经FactorXa酶消化胞外rhEPO，rhEPO浓度为298.65μg/mL。经透析、DEAE-SepharoseFF层析和Sephadex G-75层析纯化，rhEPO的回收率为39％。 结论: 实验证明pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO是能在HeLa细胞中表达rhEPO。基于TNF-α跨膜段的pcDNA3.1-TM-FactorXa-EPO跨膜真核表达载体在HeLa细胞里表达的融合蛋白是以跨膜形式存在，融合蛋白活性段在细胞外。可以用FactorXa酶切割下来，得到可控性酶切目的产物。由于表达的蛋白活性区在细胞外，高表达对宿主本身的毒性等影响较小，且易于分离纯化。