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目的:通过动物及细胞学实验研究假体周围骨溶解中肾上腺素能受体信号的作用机制,并初步探究外泌体在磨损颗粒诱导骨溶解中的作用。
方法:1.动物实验中首先建立小鼠颅骨模型,分为(A)CONTROL组(假手术组);(B)Ti组(手术造模);(C)Ti+CLEN组(手术造模后腹腔注射1mg/kg的克伦特罗);(D)Ti+PROP-LOW组(手术造模后腹腔注射0.1mg/kg的普萘洛尔);(E)Ti+PROP-HIGH组(手术造模后腹腔注射Smg/kg的普萘洛尔)。通过测量小鼠体重变化后,将小鼠出死后留取颅骨标本行Micro-CT扫描,H&E染色及TRAP染色的检测。2.体外实验中,对MC3T3-E1细胞进行实验,通过RT-PCR,Western blot技术,免疫荧光染色等,检测磨损颗粒诱导成骨细胞中的β2上腺素能受体及成骨.破骨相关分子的影响。3.通过收集磨损颗粒刺激成骨细胞的外泌体,通过透射电镜,粒径分析,Western blot技术等鉴定外泌体,并通过Western blot技术测定RANKL蛋白表达,之后将外泌体加入小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMM)后,通过TRAP染色来检测其对破骨细胞的作用。
结果:1.体内实验过程中小鼠无异常死亡,三维图像重建及Micro-CT结果提示Ti组较CONTROL组显著降低骨质密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th),而提高了骨小梁弥散程度(Tb.Sp)(P<0.05)。克伦特罗进一步降低了BMD,BV/TV,Tb.Th,并提高了Tb.Sp(P<0.05)。而普萘洛尔剂量依赖性地提高r BMD,BV/TV,Tb.Th,降低了Tb.Sp(P<0.05)。H&E及TRAP染色结果显示,Ti组中有骨面凹陷及破骨细胞形成,Ti+CLEN组则进一步加重骨面凹陷并形成了更多的破骨阳性细胞。Ti+PROP组均显著地减少了颅骨表面骨侵蚀而积及破骨细胞数量。2.体外实验显示了Ti颗粒导致MC3T3-E1细胞表面β2肾上腺素能受体(β2-AR)的表达增加,且在浓度为0.01mg/ml时达到高峰。RT-PCR显示Ti颗粒和克伦特罗均能增加RANKL mRNA的表达(P<0.05),且两者具有协同作用,进一步增加了RANKL表达(P<0.01)。而Ti+CLEN+PROP组中RANKL mRNA显著下降,而OPG mRNA于升高(P<0.05)。Ti组较CONTROL组COX-2mRNA显著升高,但肾上腺药物对COX-2mRNA无显著影响(P>0.05)。接着通过免疫荧光染色实验,验证了Ti组和CLEN组较对照组均显著提高了RANKL的表达,而普萘洛尔显著降低了RANKL的表达。3.通过透射电镜观察到提取的细胞外囊泡具有的茶杯样形态,粒径分析显示其直径在40-150nm之间,Western blot显示其高表达的TSGIOI,CD81,低表达GAPDH。而且通过共聚焦显微镜观察到小鼠骨髓来源巨噬细胞BMM细胞中有PKH67-绿色荧光标记的外泌体。接着通过Western blot检测发现0.01mg/ml的钛颗粒诱导的成骨细胞及外泌体均高表达RANKL。最后将经过M-CSF和RANKL处理的BMM和外泌体共同诱导BMM后,通过TRAP染色发现加入未处理成骨细胞外泌体组中的破骨细胞数(215.33±8.73个/孔)和未加入外泌体的组(207±12.28个/孔)无显著差异。而加入Ti颗粒外泌体组中破骨细胞数(302.66±40.8个/孔)较其余两组显著增加,有显著差异(P<0.05)。
结论:1.在小鼠模型中,克伦特罗能够促进颅骨骨面骨溶解的进展,而普萘洛尔能够剂量依赖性地降低磨损颗粒导致的颅骨骨面凹陷及减少破骨细胞数量,具有显著地抗骨吸收作用。2.在成骨细胞系MC3T3-E1中,钛颗粒通过刺激细胞表面β2-AR表达增加,进一步促进由克伦特罗激活的β2肾上腺素能信号通路,显著增加了RANKL生成,而导致骨量的迅速丢失。而β肾上腺素能受体抑制剂普萘洛尔能够显著通过阻断β2肾上腺素能受体来降低Ti颗粒诱导成骨细胞中RANKL的表达,进而抑制破骨细胞活化而减少骨吸收。3.钛颗粒可以通过刺激成骨细胞释放高表达RANKL的外泌体途径而促进骨吸收。
方法:1.动物实验中首先建立小鼠颅骨模型,分为(A)CONTROL组(假手术组);(B)Ti组(手术造模);(C)Ti+CLEN组(手术造模后腹腔注射1mg/kg的克伦特罗);(D)Ti+PROP-LOW组(手术造模后腹腔注射0.1mg/kg的普萘洛尔);(E)Ti+PROP-HIGH组(手术造模后腹腔注射Smg/kg的普萘洛尔)。通过测量小鼠体重变化后,将小鼠出死后留取颅骨标本行Micro-CT扫描,H&E染色及TRAP染色的检测。2.体外实验中,对MC3T3-E1细胞进行实验,通过RT-PCR,Western blot技术,免疫荧光染色等,检测磨损颗粒诱导成骨细胞中的β2上腺素能受体及成骨.破骨相关分子的影响。3.通过收集磨损颗粒刺激成骨细胞的外泌体,通过透射电镜,粒径分析,Western blot技术等鉴定外泌体,并通过Western blot技术测定RANKL蛋白表达,之后将外泌体加入小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMM)后,通过TRAP染色来检测其对破骨细胞的作用。
结果:1.体内实验过程中小鼠无异常死亡,三维图像重建及Micro-CT结果提示Ti组较CONTROL组显著降低骨质密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th),而提高了骨小梁弥散程度(Tb.Sp)(P<0.05)。克伦特罗进一步降低了BMD,BV/TV,Tb.Th,并提高了Tb.Sp(P<0.05)。而普萘洛尔剂量依赖性地提高r BMD,BV/TV,Tb.Th,降低了Tb.Sp(P<0.05)。H&E及TRAP染色结果显示,Ti组中有骨面凹陷及破骨细胞形成,Ti+CLEN组则进一步加重骨面凹陷并形成了更多的破骨阳性细胞。Ti+PROP组均显著地减少了颅骨表面骨侵蚀而积及破骨细胞数量。2.体外实验显示了Ti颗粒导致MC3T3-E1细胞表面β2肾上腺素能受体(β2-AR)的表达增加,且在浓度为0.01mg/ml时达到高峰。RT-PCR显示Ti颗粒和克伦特罗均能增加RANKL mRNA的表达(P<0.05),且两者具有协同作用,进一步增加了RANKL表达(P<0.01)。而Ti+CLEN+PROP组中RANKL mRNA显著下降,而OPG mRNA于升高(P<0.05)。Ti组较CONTROL组COX-2mRNA显著升高,但肾上腺药物对COX-2mRNA无显著影响(P>0.05)。接着通过免疫荧光染色实验,验证了Ti组和CLEN组较对照组均显著提高了RANKL的表达,而普萘洛尔显著降低了RANKL的表达。3.通过透射电镜观察到提取的细胞外囊泡具有的茶杯样形态,粒径分析显示其直径在40-150nm之间,Western blot显示其高表达的TSGIOI,CD81,低表达GAPDH。而且通过共聚焦显微镜观察到小鼠骨髓来源巨噬细胞BMM细胞中有PKH67-绿色荧光标记的外泌体。接着通过Western blot检测发现0.01mg/ml的钛颗粒诱导的成骨细胞及外泌体均高表达RANKL。最后将经过M-CSF和RANKL处理的BMM和外泌体共同诱导BMM后,通过TRAP染色发现加入未处理成骨细胞外泌体组中的破骨细胞数(215.33±8.73个/孔)和未加入外泌体的组(207±12.28个/孔)无显著差异。而加入Ti颗粒外泌体组中破骨细胞数(302.66±40.8个/孔)较其余两组显著增加,有显著差异(P<0.05)。
结论:1.在小鼠模型中,克伦特罗能够促进颅骨骨面骨溶解的进展,而普萘洛尔能够剂量依赖性地降低磨损颗粒导致的颅骨骨面凹陷及减少破骨细胞数量,具有显著地抗骨吸收作用。2.在成骨细胞系MC3T3-E1中,钛颗粒通过刺激细胞表面β2-AR表达增加,进一步促进由克伦特罗激活的β2肾上腺素能信号通路,显著增加了RANKL生成,而导致骨量的迅速丢失。而β肾上腺素能受体抑制剂普萘洛尔能够显著通过阻断β2肾上腺素能受体来降低Ti颗粒诱导成骨细胞中RANKL的表达,进而抑制破骨细胞活化而减少骨吸收。3.钛颗粒可以通过刺激成骨细胞释放高表达RANKL的外泌体途径而促进骨吸收。