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为提高检测HPAIVH5亚型的敏感性,缩短检测时间,降低禽肉产品储存成本,本项目利用实时荧光RT-PCR的高敏感性和反应体系的封闭性建立了实时荧光RT-PCR检测方法以进一步提高检测方法的敏感性和特异性。根据HPAIV H5血凝素（HA）基因保守区序列,合成了70对引物和4条探针,经过引物、探针筛选优化、反应体系、无机离子浓度、反转录酶筛选及浓度优化、Taq酶浓度优化等一系列的试验,建立了直接从禽肉组织中快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型的实时荧光RT-PCR方法。以4株H5亚型高致病力禽流感病毒的感染性尿囊液经稀释后进行荧光RT-PCR检测,敏感性达10-6～10-7;对鸡肉或鸭肉中可能存在的鸡传染性贫血因子、鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒（H120、H52、肾型传支）、新城疫强毒和疫苗毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭传染性肝炎病毒进行检测,结果均为阴性。表明:建立的检测方法敏感性高、特异性强。与国际标准方法一国际兽疫局（OIE）确定的鸡胚病毒分离相比,将检测时间从原来最短需要21天大大缩短为4小时。 用分离的4株HPAIV H5分别感染SPF鸡20只、肉鸡、肉鸭各30只,感染后7天内,肉鸡全部死亡,SPF鸡5天内死亡率80-90%,肉鸭在试验观察的23天内,死亡率6.7%（2/30）,绝大部分未表现临床症状。对死亡的肉鸡、SPF鸡和肉鸭的心、肝、脾、肺、肾、气管、直肠、骨髓、胸肌、腿肌、翅肌分别采样进行荧光RT-PCR检测和鸡胚病毒分离对比试验。SPF鸡肌肉组织荧光RT-PCR检测的敏感性为10-4,鸡胚病毒分离的敏感性为10-4～10-5,内脏器官荧光RT-PCR检测的敏感性为10-3～10-5,鸡胚病毒分离为10-3～10-5;肉鸡肌肉悬液荧光RT-PCR检测的敏感性为10-3～10-4,鸡胚病毒分离的敏感性为10-4～10-5,内脏器官荧光RT-PCR检测的敏感性为10-2～10-5,鸡胚病毒分离的敏感性为10-3～10-6;死亡鸭肌肉组织荧光RT-PCR检测的敏感性为10-2～10-4,鸡胚病毒分离的敏感性为10-2～10-3,各脏器荧光RT-PCR检测的敏感性为原倍～10-4,鸡胚病毒分离的敏感性为阴性～10-4。经统计学分析,两种检测方法敏感性差异不显著。对人工感染HPAIV H5未表现出临床症状的鸭分别在不同时间扑杀,取肌肉组织和脏器进行荧光RT-PCR检测,同时进行鸡胚病毒分离对比实验,结果为:感染后3天,鸭组织脏器中病毒量高用两种方法基本都能检出;感染后9—15天,组织脏器中病毒量逐渐减少,有的脏器已检不出病毒:至感染后23天,组织脏器中病毒量有所增加。 对自然感染高致病力禽流感病毒H5亚型死亡鸭肌肉组织及内脏器官进行荧光RT-PCR检测和鸡胚病毒分离,不同的个体检测结果差异较大,但两种检测方法对相同样品检测的敏感性差异不显著（P>0.05）。