论文部分内容阅读
[目的]探索神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)在新生鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中的表达及其在体外损伤皮质神经元中的作用,为临床开发新的治疗策略奠定理论基础。[方法]为了探索HIBD的分子机制,我们分别建立体内缺血缺氧性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)新生 Sprague-Dawley(SD)大鼠模型和体外糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)细胞模型。将健康新生大鼠随机分为2组:Sham组和缺血缺氧(hypoxia-ischemia,HI)组。通过TTC染色和Zea-longa评分分别对术后大鼠脑缺血状态和神经功能进行评估。利用基因芯片技术,分别检测术后大鼠右侧皮质、海马、肺组织和血清样本基因表达变化。通过String数据库对HI后大鼠右侧皮质表达差异基因相互关系进行分析。利用Venny 2.1.0在线软件对HI大鼠右侧皮质、海马、肺组织及血清样本表达变化基因进行分析。然后,通过查阅文献数据库确定研究的目的基因。利用蛋白质印迹(western blot,WB)和免疫酶组化试验分别检测皮质和海马NGF的表达水平。通过免疫荧光试验分别测定NeuN/NGF、GFAP/NGF在神经细胞中的表达情况。然后,构建NGF过表达病毒,并转染皮质神经元检测病毒转染效率。同时,将培养的神经元分为Normal组、OGD组、OGD+GFP组、OGD+NGF-ORF组,利用聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)检测不同组NGF表达的水平。此外,通过免疫荧光染色检测各组Tuj1的表达,然后分别测定各组神经元的面积、数量和轴突长度。[结果]为了研究HIBD的相关病理机制,我们建立了新生大鼠HIE模型。TTC染色结果显示,HI组大脑右侧半球可见明显白色缺血梗死灶,而Sham组无明显变化。Zea-longa评分表明,术后Sham组无神经功能缺损,而HI组大鼠呈现明显神经功能缺损。为了研究HI对新生SD大鼠基因表达的影响,我们分别检测了HI后右侧皮质、海马、肺组织及血液标本组织的基因表达变化。基因芯片结果显示,与Sham组比较,HI组右侧皮质下调基因共37个;HI组右侧海马下调基因共37个;HI组右侧肺下调基因共33个。通过String数据库对HI后大鼠右侧皮质表达差异基因进行分析,结果表明:生物学过程(BP,biological process)过程涉及220类;细胞组分(CC,cellular component)包括20种类别;分子功能(MF,molecular function)共14种。KEGG分析结果表明,下调基因明显富集的信号通路涉及32种。PPI网络图显示,所有下调基因总共有22个点,48条连线。利用Venny 2.1.0在线软件结合查询数据库对HI大鼠的皮质、海马、肺组织及血清样本明显表达下调基因进行分析,确定NGF为研究对象。WB结果显示,与Sham组比较,术后24h HI组右侧皮质NGF蛋白表达明显降低(P<0.05);术后12h和24h HI组右侧海马NGF蛋白表达降低(p<0.05)。同时,免疫酶组化试验结果表明,与Sham组比较,HI组右侧皮质和右侧海马NGF染色明显较浅,而左侧皮质和左侧海马NGF染色均相对略浅。为了进一步探索缺血缺氧后,NGF在神经元的表达情况,我们通过免疫荧光试验(NeuN/NGF)分别检测了缺血缺氧后Sham组和HI组皮质和海马的表达情况。结果显示,与Sham组比较,HI组右侧皮质和右侧海马NeuN和NGF荧光强度明显更浅,着色细胞明显减少。而HI组左侧海马和左侧皮质NeuN和NGF染色程度和着色细胞数无明显区别。共定位结果显示,NeuN和NGF染色均重叠于皮质神经元和海马神经元细胞体。相似的,为了探索缺血缺氧后,NGF在星形胶质细胞的表达情况,我们利用免疫荧光双标试验(GFAP/NGF)分别检测了缺血缺氧后Sham组和HI组皮质和海马的表达情况。结果显示,与Sham组比较,HI组右侧皮质和右侧海马GFAP和NGF荧光强度明显更浅,着色细胞数量明显减少。然而,HI组左侧海马和左侧皮质GFAP和NGF染色程度和着色细胞数量较Sham组无显著差异。共定位结果显示,GFAP和NGF染色均重叠于皮质和海马星形胶质细胞胞体。此外,为了进一步深入调查NGF表达对缺血缺氧后皮质神经元生长的影响,我们构建了慢病毒介导的NGF过表达载体,并对皮质神经元进行转染,同时利用PCR试验检测NGF过表达病毒转染后NGF基因表达水平。结果显示,HSV-NGF重组体能够很好的转染神经元。此外,PCR试验结果表明,与Normal组比较,OGD组NGF的表达水平明显降低(P<0.05);与OGD+GFP组比较,OGD+NGF-ORF组NGF的表达水平明显增高(P<0.05)。同时,为了探索NGF基因过表达对OGD皮质神经元生长的影响,我们利用HSV-NGF过表达病毒分别转染正常情况和OGD条件下培养的皮质神经元。通过免疫荧光试验结果显示,与Normal组比较,OGD组细胞Tuj1染色荧光强度明显变浅,着色细胞数量更少;与OGD+GFP组比较,OGD+NGF-ORF组细胞Tuj1染色荧光强度更深,着色细胞数量更多。定量分析结果表明,OGD组神经元细胞面积、数量和轴突长度均比Normal组明显减少(P<0.05);与OGD+GFP组比较,OGD+NGF-ORF组神经元细胞面积、数量和轴突长度均明显增加(P<0.05)。[结论]新生鼠HIBD将导致NGF表达降低,同时HSV介导的NGF表达上调能够促进缺血缺氧性损伤后皮质神经元的生长,从而可能促进HIBD的恢复。