论文部分内容阅读
卵巢黄体是一个暂时的内分泌腺体,由成熟卵泡排卵后形成。黄体的形成、发育和退化对家畜的繁殖至关重要。有研究表明NR4A1/2对卵巢细胞的激素合成、分泌和凋亡具有重要作用。最近研究发现,脂联素在调节哺乳动物生殖和细胞凋亡中亦具有重要作用,其主要通过受体激活的AMPK、PPAR和p38MAPK通路发挥作用。本论文主要采用苏木素-伊红染色(HE)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)、realtime-PCR、蛋白免疫印迹(WB)等方法,研究PGF诱导NR4A1-TV和NR4A2在假孕大鼠黄体中的表达及NR4A1/2和AdipoR/AMPK在猪卵巢黄体发育过程中的表达模式,为进一步研究NR4A1、NR4A2、AMPK和AdipoR参与调控卵巢黄体功能的分子机制提供试验依据。主要内容如下:1.PGF诱导NR4A1/2在假孕大鼠卵巢黄体中的表达为了研究NR4A1/2在PGF诱导黄体退化中的作用,采用孕马血清促性腺激素(PMSG)/人绒毛膜促性腺激素(hCG)联合处理构建大鼠假孕模型。在假孕第7天,皮下注射PGF,分别在0h、0.5h、1h、2h、4h和8h颈椎脱臼法处死大鼠,采集卵巢组织,应用WB和real-timePCR检测NR4A1/2的表达。结果发现,卵巢黄体NR4A1-F蛋白在整个处理过程中无明显变化;然而,NR4A1-TV的蛋白表达量在PGF处理0.5h显著上升(P<0.05),且在2h处达到最大值,在8h处恢复到低水平表达。NR4A2的蛋白表达模式与NR4A1-TV相似。NR4A1-P1(primer 1)mRNA在PGF注射后0.5h显著上升(P<0.05),1h处维持在高水平,然后下降;然而,NR4A1-P2(primer2)mRNA水平在整个处理阶段均无明显的变化(P>0.05)。这些结果表明,假孕大鼠体内注射PGF后,诱导的NR4A1-TV和NR4A2可能参与假孕大鼠黄体退化过程。2.NR4A1/2在猪卵巢黄体发育与退化过程中的作用初探以自然退化的猪卵巢黄体为基础,研究NR4A1和NR4A2在猪卵巢黄体自然发育与退化中的表达与定位,探讨其在猪黄体发育与退化中的潜在作用。收集不同阶段的卵巢并分离黄体(早期、中期、晚期),部分冻存,部分多聚甲醛固定。应用放射免疫法检测黄体组织中孕酮和雌二醇浓度,应用蛋白免疫印迹法检测 NR4A1/2、CYP17A1 和 cleaved-Caspase-3 的表达,应用 real time-PCR 方法检测NR4A1基因的表达量,应用免疫组织化学方法检测NR4A1和cleaved-Caspase-3定位。放射免疫测定结果显示,与中期相比,晚期孕酮水平显著下降,然而雌二醇水平显著升高(P<0.05);CYP17A1蛋白在早期黄体与中期黄体无显著差异(P>0.05),晚期黄体显著上升(P<0.05);早期黄体与中期黄体NR4A1和NR4A2蛋白表达量无显著变化(P>0.05),晚期黄体中NR4A1和NR4A2蛋白均显著下降(P<0.05);Cleaved-Caspase-3蛋白在中期黄体中表达最低,晚期黄体中表达最高;NR4A1-P3/4mRNA表达模式相似,中期黄体中表达量最高。整个黄体退化过程中,NR4A1主要在黄体类固醇生成细胞的细胞质中表达,而cleaved-Caspase-3在包括黄体类固醇生成细胞在内的所有细胞的胞质中表达。上述结果表明,NR4A1和NR4A2可能参与调控猪黄体组织中孕酮的合成代谢,为深入研究NR4A1/2参与猪卵巢机能调控提供理论依据。3.AdipoR/AMPK在猪卵巢黄体发育与退化过程中的表达以自然状态的猪卵巢黄体和非黄体组织为基础,研究AMPK和AdipoR在猪卵巢中的表达模式,探讨其在猪黄体发育和退化中的潜在作用。采集猪黄体发育不同阶段的卵巢黄体和非黄体组织,应用PCR和Western blot技术检测AMPK和AdipoR的表达。结果发现,黄体类固醇生成细胞标记蛋白StAR蛋白在中期黄体中表达最高,晚期黄体中表达最低;黄体组织中AdipoR1蛋白表达水平在黄体发育的各个时期无显著差异,而在非黄体组织中,AdipoR1蛋白在早期和中期表达水平较高,后期显著下降。real time-PCR结果显示,晚期黄体组织中AMPK mRNA和AdipoRmRNA表达量均最低;AMPKa1 mRNA在晚期非黄体组织中表达量最高;AMPKa2mRNA中期黄体组织中表达最高;AMPKβ1mRNA在中期非黄体组织中表达最高;AMPKγ1 mRNA早期非黄体组织中表达最高;AMPKγ3 mRNA在早期非黄体组织表达最高;AdipoR1mRNA在中期非黄体组织中表达最高;AdipoR2 mRNA中期黄体组织中表达最高(P<0.05)。上述结果表明,AMPK和AdipoR1/2可能参与调控猪卵巢黄体的功能,为进一步研究猪黄体功能调控的分子机制提供试验依据。