研究背景与研究目的乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)通过血液传播、母婴垂直传播和性传播等途径感染人体而引发的肝脏疾病,是影响全球人口健康的重要原因。据统计,全球有20亿人口曾经感染过HBV。我国是乙型肝炎的高发地区,患病率高达5%-7%,我们需要予以高度重视[1]。HBeAg血清学转换是指HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者体内血清的HBeAg消失而HBeAb产生的现象。有研究发现,达到了 HBeAg血清学转换的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者长期预后较好,慢性乙型肝炎引起的并发症如肝硬化、原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生率也大大降低[2-5]。因此,EASL和AASLD等各大国际性乙肝防治指南将HBeAg血清学转换作为HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的停药指标之一[6-8]。我们的前期试验,通过纵向队列研究,发现替比夫定(Telbivudine,LDT)治疗12周HBeAg血清学转换组的血清IL-21显著性升高,提示了 IL-21与HBeAg的血清学转换有一定的关系[9]。白细胞介素21(Interleukin-21,IL-21)是由活化的CD4+T细胞分泌的细胞因子,其中主要由滤泡辅助性T细胞(FollicularThelpercells,Tfh)和Th17细胞分泌。作为IL-2家族的一员,IL-21和该家族的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等的细胞因子受体均含有γ链(CD132)[10-13]。由于IL-21R(Interleukin-21 receptor)在各类细胞的广泛分布,因此可通过各类细胞来发挥多种效能。它可以促进B细胞分化成浆细胞产生免疫球蛋白并促进免疫球蛋白的类别转换等,也可以促进NK(Natural killer)细胞、CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶等从而增强了其细胞毒性作用[10,14,15]。有研究表示,IL-21在慢性病毒感染过程中达到病毒学控制发挥着重要的作用。在慢性病毒感染过程中会出现CD4+和CD8+T细胞的部分耗竭,而在慢性感染的后期CD4+T细胞大量地分泌IL-21,作用于记忆性的CD8+T细胞,使其增殖并增强了细胞杀伤性作用,从而达到了病毒学控制[16]。结合目前研究现状和我们对IL-21与HBeAg血清学转换关系的探讨,我们发现IL-21在HBV感染过程中发挥其免疫调节作用从而有利于疾病转归,这也是近几年的研究热点。我们的前期研究发现,慢性乙型肝炎患者体内IL-21水平较健康人明显升高,提示IL-21在慢性乙型肝炎感染中表达上调可能是机体对抗HBV的一种保护性免疫方式。体外研究也表明,外周血Tfh细胞可通过分泌IL-21促进HBeAg血清学转换。但由于人群研究容易受个体遗传背景不同、感染时间差异不一以及病毒致病性等因素的影响,且无法进行体内的干预,因此有必要在遗传背景较为一致且能进行人为性干预的动物模型中进行进一步的研究。目前,IL-21在HBV感染小鼠模型中的研究尚不多见。因此,我们的课题将围绕着IL-21在HBV感染过程中的作用机制,采用HBV小鼠模型进行进一步的研究。HBV小鼠模型主要有以下几种:HBV转基因小鼠、人鼠嵌合HBV模型、质粒转染HBV小鼠模型、病毒转导HBV小鼠模型。HBV转基因小鼠是通过受精卵注射技术将HBV基因整合至小鼠受精卵基因组内的模型;人鼠嵌合HBV模型是通过人胎肝细胞以及(或者)免疫细胞移植至胎鼠体内,再在小鼠体内注射HBV患者血清;质粒转染HBV小鼠模型是采用静脉高压水动力转染法注射含HBV基因的载体;病毒转导HBV小鼠模型是通过病毒载体转导法静脉注射含HBV基因的嗜肝性病毒载体所建立的模型[17,18]。根据各种模型的特点结合我们实验研究的目的,我们选择了 rAAV8-HBV1.3以及pSM2建立HBV小鼠模型。有学者通过IL-21和IL-21R敲除小鼠来建立慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染模型,并发现该敲除小鼠较正常小鼠模型对于慢性病毒感染更加脆弱易感且易迁延不愈[19,20]。这些研究背景给了我们此课题新的思路和启发。因此,我们围绕对IL-21在HBV小鼠模型中的作用机制的探讨,将本课题分为两条路线进行,其一采用IL-21R基因敲除小鼠和野生型小鼠来建立HBV小鼠模型,其二在HBV小鼠模型体内外源性添加rmIL-21与对照rIgG,从病毒学和免疫学两方面对IL-21在HBV感染中发挥免疫调节效能的机制作初步的探究。研究方法1、采用pSM2建立HBV小鼠模型。在野生型小鼠身上高压尾静脉注射10ug pSM2(模型组)以及其对照质粒pUC19(对照组),两组各21例,建模时长为28天,从建模后第1天至第28天,每隔2天采集小鼠静脉血,第28天处死小鼠取肝组织。(1)ELISA检测各个采血点的血清,观察HBsAg,HBsAb和IL-21的水平;(2)流式细胞术检测建模第0、7、28天外周血的CXCR5+CD4+T细胞和CD19+B细胞的频数;(3)实时荧光定量PCR检测肝内IL-21 mRNA的水平;(4)流式细胞术检测肝内CXCR5+CD4+T细胞和CD19+B细胞的频数;(5)采用免疫组化检测肝内HBcAg表达情况;(6)对肝组织进行HE染色,观察肝内炎症浸润情况。2、采用IL-21R基因敲除小鼠和pSM2质粒建立HBV小鼠模型,动态观察期间病毒学和免疫学的改变,从IL-21缺失角度探究IL-21对HBV感染的影响。于IL-21R基因敲除小鼠高压尾静脉注射10ug pSM2质粒,野生型小鼠同时建模作为对照组,两组例数均大于10,建模时长为28天,从建模后第1天至第28天,每隔2天采集小鼠静脉血,分别在建模后第7、14、21、28天处死小鼠取肝脾组织。(1)ELISA检测各个采血点的血清,观察HBsAg,HBsAb和IL-21的水平;(2)实时荧光定量PCR检测建模后第28天肝内IL-21 mRNA的水平;(3)分离肝脾内淋巴细胞,HBV重叠多肽刺激培养5小时后流式细胞术检测四个处死时间点肝脾内HBV特异性T细胞的功能。3、rAAV8-HBV1.3建立HBV小鼠模型,并给予鼠源性IL-21,观察建模期间rmIL-21是否可促进HBV小鼠模型体内病毒的清除。采用含1.3拷贝HBV基因组的AAV8重组病毒载体(rAAV8-HBV1.3),注射量为2×1010vg/200ul/只,常规尾静脉注射20只野生型小鼠建立HBV小鼠模型。在建模4周后,根据第4周的血清HBsAg水平配对分成干预组和对照组,干预组小鼠通过腹腔注射鼠源性的IL-21,而对照组用同样的方式注射rIgG,隔天1次,注射24天后再观察24天,共48天,每隔6天采集静脉血,ELISA检测血清HBsAg的动态变化。4、统计学分析。采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5.0进行数据分析和作图,计量资料以均数±标准差或四分位间距表示。若资料为符合正态分布及方差齐性的计量资料就采用参数检验,否则采用非参数检验。两组间均值比较采用两个独立样本t检验或者两个独立样本秩和检验(Mann-Whitney),双变量间关系检验采用等级相关分析(Spearman correlation),所有统计分析基于双尾假设检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1、成功通过pSM2建立HBV小鼠模型,该模型外周血和肝内CXCR5+CD4+T细胞、CD19+B细胞频数以及IL-21水平升高,随后HBsAg清除并逐渐出现HBsAb。pSM2建立的HBV小鼠模型,第13天所有小鼠血清的HBsAg清除,第7天部分小鼠血清开始产生HBsAb,建模后第28天肝内免疫组化可见HBcAg的表达。模型组的血清IL-21水平在第7天开始逐渐升高且显著性高于基线(P<0.05),并在第28天达到最大值,而对照组无明显变化。采用实时荧光定量PCR的方法检测发现,模型组肝内IL-21水平也显著高于对照组(P<0.05)。进一步分析建模后第7天、第28天小鼠模型外周血和第28天肝内CXCR5+CD4+T细胞和CD19+B细胞的频数,发现显著高于基线(P<0.05),而对照组无明显变化。HE染色可以看到,较对照组pSM2注射小鼠肝内有淋巴细胞浸润。2、与野生型小鼠相比,IL-21R基因敲除小鼠通过pSM2质粒建立的HBV小鼠模型的病毒清除延迟并且不能产生抗体。ELISA检测两组小鼠血清HBsAg和HBsAb可见,IL-21R基因敲除小鼠血清HBsAg持续时间延长,建模第10天开始HBsAg水平显著性高于野生型小鼠(P<0.05),部分IL-21R基因敲除小鼠血清内HBsAg表达可持续28天以上。而较野生型小鼠,所有IL-21R基因敲除小鼠均不能产生HBsAb并在第22天显著低于野生型小鼠(P<0.05)。观察两组IL-21的表达水平,显示早期两种小鼠的血清IL-21水平没有显著差异,但到第22天之后,IL-21R基因敲除小鼠的血清IL-21水平显著性低于野生型小鼠(P<0.05),肝内IL-21水平也呈现同样的趋势(P<0.05)。进一步分析血清内HBsAg、HBsAb分别和IL-21的关系,结果发现IL-21 和 HBsAg 呈负相关(r=-0.222,P=0.001),而与 HBsAb 呈正相关(r=0.355,P<0.001)。流式细胞术对建模后第7天、14天、22天和28天的HBV特异性检测发现,肝脾内HBV特异性T细胞功能在22天达到高峰,随后逐渐下降,更重要的是,除了第28天两组肝内CD4+IFN-γ+T细胞频数表达无统计学差异外,第22天和28天的野生型小鼠肝脾内针对HBV抗原肽特异性分泌干扰素(IFN-γ)的CD4+、CD8+亚群的细胞比例均高于IL-21R敲除小鼠(P<0.05)。3、在对HBV小鼠模型给予鼠源性IL-21后,小鼠血清HBsAg逐渐下降。在用鼠源性IL-21处理HBV小鼠模型的第6天开始,血清HBsAg较对照组大幅度下降(P<0.05),但随后并无明显的变化,保持着低水平一直持续到停止给予rmIL-21后第24天,并且在观察期间各采血点均显著低于对照组(P<0.05)。结论1、IL-21可促进注射pSM2小鼠模型体内HBV抗原的清除和抗体的产生;2、高压尾静脉注射pSM2质粒的IL-21R基因敲除小鼠较野生型小鼠,HBV抗原清除延迟且未检测到HBsAb的产生;3、注射鼠源性IL-21可促进rAAV8-HBV1.3病毒体内转导法建立的HBV持续表达小鼠体内HBsAg的清除。