研究背景和目的肺炎是呼吸系统常见疾病,重症肺炎（severe community-acquired pneumonia,SCAP）因其疗效差,病情发展迅猛,易引发全身炎症反应综合征（systemicinflammatory response syndrome,SIRS）、多器官功能障碍综合征（MultipleSystem Organ dysfunction,MODS）等严重并发症甚至造成人员死亡,成为威胁人类健康的一大问题。引起SCAP的原因很多,发病机制复杂,一般由严重的细菌或/和病毒感染所致。在感染或非感染因素作用下,肺内的炎性细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等活化后产生内源或外源性炎性物质如细胞因子、凝血和纤溶物质、血管活性肽、黏附因子、迟发性炎性物质如高迁移率蛋白分子等引起炎症反应,发挥机体的防御作用。既往认为,重症肺炎造成病情加重、多组织器官出现损伤及功能不全是病原体或毒素直接作用的结果。现阶段看法不尽然,大量研究表明,初始炎症信号经过活化扩大后,上述的内、外源性炎症介质表达迅速上调,失控性释放,激发连锁“瀑布效应”（cascade effect,CE）,使炎性/抗炎反应失衡,免疫功能紊乱,机体组织细胞发生凋亡及坏死,最终导致重症肺炎及严重并发症。在上述的各种炎症介质中,促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡失调是感染进一步发展为SIRS及脓毒症的关键。目前已知的促炎细胞因子主要有肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）、白介素-1（Interleukin-1,IL-1）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-8（Interleukin-8,IL-8）等,抗炎性细胞因子主要有白介素-4（Interleukin-4,IL-4）、白介素-10（Interleukin-10,IL-10）、白介素-13（Interleukin-13,IL-13）等。TNF-a与靶细胞膜表面的TNF受体作用,激活多种信号转导途径、激酶和转录调节因子,活化细胞基因,产生广泛的生物学作用。业已明确,在机体处于严重创伤感染的状态下,肿瘤坏死因子TNF可以通过诱导次级炎性介质的释放,引起“炎症级联效应”,介导机体高代谢状态,激活内皮细胞、各脏器实质细胞凋亡通路等一系列复杂的病理生理学作用,使各系统脏器由细胞损伤破坏进而发展为脏器功能衰竭。TNF-a可诱发IL-1、IL-6、IL-8以及继发性炎症介质的产生,并由此进一步激发炎症连锁反应;同时可激活凝血及补体系统,促进黏附分子、前列腺素E2、血小板刺激因子、糖皮质激素等强效致炎因子的释放和表达,进一步加重肺组织损伤。TNF-a被认为是重症肺炎发病中的重要促炎介质,在肺部炎症中,TNF-a通过促进中性粒细胞表面细胞黏附分子CD11/18表达及自由基释放,介导粒细胞在心肺循环中黏附于肺毛细血管内皮上,进而损伤血管内皮。研究发现TNF-a在SIRS早期普遍升高,在发生MODS时增高更为明显,血中的TNF-a水平对判断重症肺炎的病情进展具有预警作用。白细胞介素家族（interleukins,ILs）多个成员被证实与肺炎关系密切,如促炎细胞因子IL-1、IL-6及抗炎细胞因子IL-10等。IL-1是急性期免疫反应的主要调节因子,可通过刺激下丘脑前部的前列腺激动中枢而诱导典型的炎症发热反应,此外还可通过改变内皮细胞中黏附分子的表达和分布而发挥重要作用。研究表明,脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是单核一巨噬细胞合成分泌IL-1的强烈刺激剂。IL-6在过度炎症反应时大量分泌,诱发血管内皮细胞及微循环的一系列炎症改变,对血管内皮细胞及炎症细胞具有直接激活和毒性作用,促进肝细胞分泌急性期蛋白。目前大量研究发现IL-6水平增高是最早出现的感染指标,比常规的C.反应蛋白要提前很多,血浆高水平的IL-6与CAP和ARDS的高病死率有关。Monton等发现,在重症肺炎中使用糖皮质激素使IL-6下降,病死率有降低。IL-10是一个以免疫抑制为主的多向免疫调节因子,主要生物活性表现为直接抑制炎症细胞的活化进而抑制细胞因子的产生。它能在转录、转录后两个阶段上影响前炎症因子的水平。IL-10不仅能抑制前炎性细胞因子相应基因的转录而阻断其合成,同时还能影响前炎性细胞因子mRNA的稳定性,使得其水平下降。另外它还可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）的激活,从而抑制内毒素性ALI大鼠模型的肺泡巨噬细胞释放TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性细胞因子,减少使白细胞聚集的炎性介质和黏附分子,减轻炎症反应。TNF-a、IL-1、IL-6、IL-10等细胞因子在重症肺炎的发生发展的作用不可忽略。如何针对重症肺炎时出现的炎性/抗炎失衡进行深入研究,寻求治疗新途径是目前人类面临的课题,以往对细胞因子、免疫调节、抗氧化剂治疗的探索火热,特别是细胞因子拮抗剂方面的研究,部分动物实验研究中确实有较多结果提示炎症细胞因子有潜在的临床应用价值,但在临床试验中并没有得到类似结果。相反,还有一些使病死率增加的数据,可见,炎症反应是一个及其复杂的网络系统,单纯的拮抗炎症细胞因子的治疗不能取得满意的疗效。近年来随着分子生物学技术的发展,利用siRNA干扰使靶基因沉默从而调节目的蛋白功能,显示出巨大的应用潜力。NF-κB因其在炎症反应中参与多种炎症介质基因的转录和调控,引起国内外学者的极大关注和兴趣,目前在一些疾病如类风湿性关节炎的基础研究及前期临床研究中已经取得一些成效。NF-κB最初在鼠成熟B细胞和粒细胞瘤中发现并命名为细胞核Kappa轻链基因表达的调节子,后来研究发现其存在于多种细胞中。NF-κB通常以同源或异源二聚体p50/p65非活性形式存在于几乎所有类型细胞的胞质,P65具有使调控基因转录活性增强的作用,而P50则与调控基因结合的亲和力有关。在静态细胞,p50/p65二聚体在血浆中与I-κBa、I-κBβ和I-κBγ等NF-κB抑制家族蛋白（Iκds）结合,隐藏p65与靶DNA结合的关键的氨基酸残基,抑制NF-κB与靶DNA调节区的特异性结合。NF-κB在炎症介质的过度释放中起着关键作用。炎症反应发生时,前炎性因子TNF-a,IL-1β及脂多糖（LPS）等多种因素可诱导多种细胞如人外周血单核细胞、内皮细胞和肺组织的NF-κB的活化。IκBs的氨基末端第32,36位丝氨酸残基从NF-κB-IκBs复合物中突起,很容易被IκBs蛋白激酶磷酸化,磷酸化的IκBs进一步被蛋白酶降解,使NF-κB从NF-κB-IκBs复合物中解离出并转位于细胞核,与相应的靶基因结合,调节靶基因的转录。有报道NF-κB/Relp50和p65亚单位在体内对抑制脓毒血症或感染性休克时的高死亡率起着重要作用。经NF-κB调控的基因超过150余种,与免疫细胞的活化,T、B淋巴细胞的发育,炎性反应,细胞凋亡等多种细胞活动有关,更与多种炎症介质的相关基因的表达有关,如炎性蛋白质包括单核细胞趋化因子MCP-1,MCP-2,MCP-3;巨噬细胞炎性蛋白MIP-1a,MIP-1b,MIP-2;细胞因子TNF-a,IL-1β,IL-8;趋化因子IL-8和诱导性一氧化氮合酶iNOS;黏附因子如细胞间黏附因子（ICAM-1）、血管细胞黏附因子（VCAM-1）和E选择素等。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调节机制。其实质是通过双链RNA使目的mRNA降解,从而特异性地抑制目的蛋白表达。与常规的基因敲除、反义寡核苷酸和小分子阻断剂相比,siRNA有明显的优势:基因敲除技术虽然很有效,但需要大量的人力和财力,同时致死变异可能阻碍胚胎发育;反义寡核苷酸和小分子阻断剂虽然简单便宜,但稳定性和准确性稍差;而siRNA不但有效而且特异性高,从而为研究大量基因的功能和广泛应用提供了保证。目前NF-κB在不同疾病中的重要作用以及与之相关的治疗策略成为热点,尤其是利用siRNA技术对NF-κB相应基因的沉默来改变其对目的基因的调控以及对炎性调控机制的进一步探索,使得很多疾病有望得以控制,如移植、肿瘤、凋亡、类风湿性关节炎等方面的基础研究已经取得一些成效。尽管NF-κB和炎性反应关系密切,可以增强多种炎性介质如TNF-a、IL-1β、IL-8以及黏附因子的转录,且可被内毒素、TNF-a、IL-1β所激活,但利用NF-κB的沉默来控制和治疗肺炎方面的研究却鲜有报道。从基因水平对肺炎进行干预在理论上是一种很有潜力的新方法。为了研究NF-κB p65基因在炎症中的作用和地位,本课题选择增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告分子,利用化学合成方法合成3对针对NF-κB p65基因的siRNA,通过预实验筛选出干扰效果最佳的NF-κB p65 mRNA的siRNA序列,在体外培养的小鼠巨噬细胞株Ana-1中,拟通过RNAi技术沉默巨噬细胞NF-κB p65基因,探讨对其下游多个对重症肺炎发生发展关系密切的细胞因子表达的影响,为重症肺炎从基因层面进行防治提供理论依据。方法1、设计并合成NF-kB p65 siRNA。美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中寻找小鼠NF-kB p65的mRNA序列全长,根据文献报道进行目标序列选取,使用BLAST将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较,排除和其他编码序列同源的序列,确定小鼠NF-kBp65的siRNA目标基因序列。2、细胞培养、瞬时转染NF-kB p65 siRNA。Ana-1细胞用高糖的1640培养基加10%小牛血清进行培养,无需胰酶消化,直接吸管吹打即可传代,选用指数生长期细胞六孔板铺板。根据脂质体Lipofectamine ^TM2000说明书对siRNA和脂质体用量进行优化实验,以提高转染效率。最终选用siRNA的浓度为50pmol,Lipofectamine ^TM2000体积为5ul作为每孔细胞的转染剂量。将3对siRNA通过Lipofectamine ^TM2000共转染Ana-1细胞株,通过荧光显微镜观察荧光强度,挑选出转染率最高的一对siRNA用于下一步实验。3、转染24小时后,RT-PCR检测细胞内NF-kB p65 mRNA表达,Western blot检测细胞内NF-kB p65蛋白表达。将转染率最高的siRNA、阴性对照siRNA、阳性对照siRNA通过转染试剂转入Ana-1细胞株,同时设置空白对照组（即无任何siRNA组）,转染24小时后利用RT-PCR方法进行检测各组NF-kB p65 mRNA的表达;Western blot方法检测各组细胞内NF-kB p65蛋白的表达。4、LPS刺激NF-kB p65基因干扰后和未干扰的巨噬细胞Ana-1,通过ELISA方法检测两者细胞上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10含量。培养Ana-1细胞至指数生长期,一组细胞经NF-kB p65 siRNA干扰24小时后,另一组细胞未经干扰,两组同时予LPS刺激,通过ELISA方法检测两组细胞上清中与感染进展关系密切的各细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10含量的变化。结果1、细胞内NF-kB p65的变化NF-kB p65 siRNA转染细胞24h后,RT-PCR结果显示:ANA-1细胞未经LPS刺激时,沉默组与对照组相比NF-kB p65 mRNA表达显著降低（0.483±0.085vs.0.903±0.069）,具统计学差异（P=0.000）,而阴性对照组、阳性对照组与空白组相比较,无显著差异（P=0.712,P=0.358）。LPS刺激ANA-1细胞后,沉默组与对照组相比NF-kB p65 mRNA表达显著降低（0.404±0.068 vs.1.067±0.064）,具统计学差异（P=0.000）,而阴性对照组、阳性对照组与空白组相比较,无显著差异（P=0.346,P=0.361）。NF-kB p65 siRNA转染细胞24h后,Westem blot结果显示:ANA-1细胞未经LPS刺激时,沉默组与对照组相比NF-kB p65蛋白表达显著降低（0.429±0.087vs.0.889±0.059）,具统计学差异（p=0.000）,而阴性对照组、阳性对照组与空白组相比较,无显著差异（P=0.271,P=0.360）。LPS刺激ANA-1细胞后,沉默组与对照组相比NF-kB p65蛋白表达显著降低（0.589±0.107 vs.1.074±0.059）,具统计学差异（P=0.000）,而阴性对照组、阳性对照组与空白组相比较,无显著差异（P=0.523,P=0.809）。2、Ana-1细胞NF-kB p65基因沉默后TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10动态变化TNF-a:LPS刺激后4h、12h、24h TNF-a表达量增多,较未刺激时（0h）有明显差异（P＜0.05或P＜0.01）,刺激后12h出现峰值,RNA干扰组TNF-a表达量相应时间点（除0h外）较对照组均有不同程度降低（P＜0.05）。IL-1β:LPS刺激后4h、12h、24h IL-1β表达量增多,较未刺激时（0h）有明显差异（P＜0.05或P＜0.01）,刺激后12h出现峰值,RNA干扰组IL-1β表达量相应时间点（除0h外）较对照组不同程度降低（P＜0.05）。IL-6:LPS刺激后4h、12h、24h IL-6表达量增多,较未刺激时（0h）有显著差异（P＜0.01）,刺激后12h出现峰值,RNA干扰组相应时间点（除0h外）IL-6表达量较对照组均有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。IL-10:LPS刺激后4h、12h、24h IL-10表达量增多,较未刺激时（0h）有差异（P＜0.05或P＜0.01）,RNA干扰后12h、24h IL-10表达量较对照组增多（P＜0.05）,其余时间点未见明显差异。结论本研究发现:1、通过RNAi技术沉默巨噬细胞Ana-1 NF-kB p65基因,24h后用RT-PCR与Western blot方法检测LPS刺激组与LPS未刺激组NF-kB p65的表达情况,发现无论LPS刺激与否,沉默组与对照组相比,NF-kB p65表达都出现显著降低。即采用RNAi技术沉默Ana-1 NF-kB p65基因,24小时即可基本抑制其表达。2、Ana-1细胞NF-kB p65基因沉默24h后给予LPS（1ug/m1）刺激,通过ELISA方法检测不同时间点（0h、4h、12h、24h）细胞上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10的含量,并与未沉默组相对照,发现经NF-kB p65基因沉默的Ana-1细胞受LPS刺激后促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的表达明显减少,抑炎因子IL-10的表达增多。3、NF-kB p65对早期炎症细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10的表达具有调控作用。