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第一部分:大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中Mfsd2a表达变化目的:研究大鼠实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后Mfsd2a在大脑组织中表达的动态变化趋势方法:随机选取42只SD大鼠,分为假手术组(sham组)和SAH后12 h、24h、48h、3d、5d、7d共7组,每组6只大鼠,采用单次视交叉前池注血法制造大鼠SAH模型,所有的大鼠都在相应的时间点被处死,经心脏灌注后完整取出脑组织,采集大鼠双侧颞底部脑组织,并制作石蜡切片,利用Western blot技术检测Mfsd2a表达的变化。利用免疫荧光共染技术检测Mfsd2a在脑组织中的表达和具体定位。结果:1.大鼠SAH后脑组织中Mfsd2a蛋白水平在SAH后的12小时开始下降,到SAH后第3天降至最低,为sham组的60%,而后逐渐回升,至SAH后第7天恢复至sham组水平2.免疫荧光共染显示Mfsd2a的表达位于血管内皮细胞细胞膜上。结论:1.SAH发生后12小时内,Mfsd2a表达开始下降,到SAH发生后3天,Mfsd2a表达达到最低,随后逐渐恢复。2.Mfsd2a主要位于脑内微血管内皮细胞细胞膜上表达。第二部分:Mfsd2a对蛛网膜下腔出血后血脑屏障及神经功能影响的研究目的:研究Mfsd2a表达改变在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后恢复期中发挥的作用方法:随机选取180只SD大鼠,分为sham组、SAH组、SAH+小干扰RNA对照组(CtrSiRNA 组)、SAH+小干扰 RNA-Mfsd2a 组(SiRNA 组)、SAH+空载过表达质粒对照组(Vehicle组)、SAH+Mfsd2a过表达质粒组(OVER-MFSD2A组)。共计6组,每组30只大鼠,造模前48小时通过侧脑室注射相应的溶剂用以调控Mfsd2a的表达,随后采用单次视交叉前池注血法制造大鼠SAH模型。部分大鼠在SAH后3天被处死,经心脏灌注后完整取出脑组织,采集大鼠双侧颞底部脑组织,利用Western blot 技术检测 Mfsd2a、白蛋白(Albumin)、紧密连接蛋白1(ZO-1)、Slit-Robo RhoGTP酶激动蛋白2(SrGAP2)、膜泡运输蛋白同源物B(SEC22b)、细胞膜穴样内陷蛋白1(Caveolin-1)表达的变化。采用Morris水迷宫(MWM)法评估大鼠的空间学习和记忆能力。采用转棒实验和贴纸实验评估大鼠的运动能力。采用伊凡氏蓝(Evans Blue)法染色评估大鼠血脑屏障(BBB)完整性。采用干湿重法测量大鼠脑组织含水量。结果:1.抑制Mfsd2a表达的大鼠在SAH后3天时,脑内Albumin含量以及SrGAP2,SEC22b,Caveolin-1的表达相比对照组增多,过表达Mfsd2a表达的大鼠脑内Albumin含量以及SrGAP2,SEC22b,Caveolin-1的表达相比对照组减少。所有SAH组的大鼠脑内ZO-1表达都低于sham组,但增加或抑制Mfsd2a表达后ZO-1表达没有明显变化。2.大鼠在SAH后空间学习能力,记忆能力和运动能力都有下降,抑制Mfsd2a表达的大鼠下降更多,过表达Mfsd2a的大鼠下降幅度减少。3.SAH后3天大鼠血脑屏障通透性高于sham组,抑制Mfsd2a表达的大鼠血脑屏障通透性比对照组更高,过表达Mfsd2a的大鼠血脑屏障通透性比对照组降低。4.相比sham组,SAH后3天时大鼠脑组织含水量更高,抑制Mfsd2a表达的大鼠脑组织含水量较对照组更高,过表达Mfsd2a的大鼠脑组织含水量较对照组降低。结论:增加Mfsd2a表达在大鼠实验性SAH后有助于抑制内皮细胞主动运输,保护血脑屏障,降低脑含水量,改善脑水肿程度及预后,但对血脑屏障中的紧密连接无保护作用。第三部分:Mfsd2a对大鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障保护作用的机制研究目的:研究Mfsd2a在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后对血脑屏障(BBB)的保护作用的机制以及二十二碳六烯酸(DHA)在其中发挥的作用方法:随机选取108只SD大鼠,分为对照饮食组和DHA缺乏饮食组,分别予以正常饲料及定制DHA缺乏饲料,每组再分为三小组,分别是sham组、SAH+空载过表达质粒对照组(Vehicle组)、SAH+Mfsd2a过表达质粒组(OVER-MFSD2A组),共计6组。造模前48小时通过侧脑室注射相应的溶剂用以调控Mfsd2a的表达,随后采用单次视交叉前池注血法制造大鼠SAH模型。部分大鼠在SAH后3天被处死,经心脏灌注后完整取出脑组织,采集大鼠双侧颞底部脑组织,并制作石蜡切片,利用Western blot技术检测Caveolin-1表达以及Albumin含量。采用伊凡氏蓝(Evans Blue)法染色评估大鼠血脑屏障(BBB)完整性。利用免疫荧光共染技术检测脑内免疫球蛋白G(IgG)渗漏点数量,Caveolin-1在脑组织中的表达和具体定位。结果:1.在对照饮食组中,大鼠SAH后3天时Caveolin-1表达及Albumin含量相对于sham组明显升高,过表达Mfsd2a后相对于对照组明显下降;而在DHA缺乏饮食组中,过表达Mfsd2a对于SAH后大鼠脑内Caveolin-1表达及Albumin含量无明显影响。2.在对照饮食组中,大鼠SAH后3天时相对于sham组血脑屏障通透性明显增加,过表达Mfsd2a后血脑屏障通透性相对于对照组明显下降。而在DHA缺乏饮食组中,过表达Mfsd2a对于SAH后大鼠血脑屏障通透性变化无明显影响。3.Caveolin-1主要位于血管内皮细胞表达。结论:在正常饮食情况下,增加Mfsd2a的表达可以通过提高内皮细胞中DHA含量来抑制细胞膜穴样内陷(caveolae)的产生,从而保护血脑屏障,当缺乏DHA时,这一保护作用消失。