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目的:红芪多糖是传统中药红芪 Hedysaym polybotrysr Hand.-Mazz.的主要药用成分之一。随着中药多糖增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射作用的发现,近年来,红芪多糖也引起了愈来愈多的关注。前期的研究表明:红芪总多糖具有抑瘤效应和提高免疫功能的作用。由于红芪多糖的结构目前尚未阐明,故本研究通过对红芪均一性多糖的结构测定、抗肿瘤作用的比较和诱导肿瘤细胞凋亡机理的探讨,为阐明红芪多糖抗肿瘤作用的构效关系和作用机制奠定基础,为挖掘潜在的抗肿瘤红芪多糖提供试验依据。
方法:(1)用尺寸排阻色谱对红芪总多糖进行分离纯化,得到3种均一性红芪多糖。用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、HPSEC、UV等分析方法对3种多糖的总糖、蛋白、均一性及分子量等理化指标进行了测定。(2)采用化学方法,包括:多糖全水解、甲基化分析及仪器分析方法,包括:GC,GC-MS,IR,NMR,ESI-MS等对红芪多糖HPS-1和HPS-3的一级结构特征进行测定。(3)MTT法测定3种红芪多糖及总多糖对2种体外培养的肿瘤细胞增殖的影响。 (4)通过倒置显微镜、电镜观察和Hochest 33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学改变:流式细胞仪PI单染色法检测细胞周期变化:流式细胞仪检测Bcl-2、Fas和Caspase-3蛋白表达。
结果:
(1)所得的3种红芪多糖HPS-1,HPS-2和HPS-3的HPSEC谱中呈现单一对称峰,表明其均为均一性多糖。3种多糖的理化性质有一定的差异。
(2)红芪多糖HPS-1的分子量为9.4×10<4>Da,组成的单糖仅为α-D-Glcp;HPS-2的分子量为6.4×10<4>Da,组成的单糖为α-D-xylp,α-D-Galp 和α-D-Glcp,摩尔比为0.14:0.16:1.00;HPS-3的分子量为 1.7×10<4>Da,单糖的组成为α-L-Rhap,α-D-Xylp,α-D-Galp和α-D-Glcp,摩尔比为0.04:0.19:0.19:1.00。在多糖的 NMR 谱,ESI-MS谱中均出现了以上糖残基的特征信号,IR谱中出现了a-Glcp的特征吸收峰。
(3)3种红芪多糖及总多糖对体外培养的2种人肿瘤细胞增殖的影响具有很大差异;其中HPS-3的作用比较突出,有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,且这种作用具有明显的时效与量效关系。
(4)红芪多糖HPS-3作用于MGC-803细胞后,可见明显的凋亡细胞和凋亡峰,G<,2>/M期的细胞比例增高,凋亡率随着药物浓度的增加而加大,400μg/L 时的凋亡率可达8.3±0.15%(P<0.01);随着HPS-3浓度的增加,细胞浆中Bcl-2的表达逐渐降低,细胞中Caspase-3蛋白的表达逐渐升高;但是Fas蛋白表达无明显变化。
结论:
(1) 红芪多糖HPS-1是由(1→4)-α-D-Glcp和(1→6)-α-D-Glcp连接而成的葡聚糖;红芪多糖HPS-3是一种主链由(1→6)-α-D-Glcp,(1→6)-α-D-Galp和α-D-Xylp-(1→重复片段构成,支链由β-D-Galp-(1→2)-α-L-Rhap残基连接而成的水溶性杂多糖。
(2)3种红芪多糖及总多糖具有不同的体外抗肿瘤作用,HPS-1对HEP-G2肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用,HPS-3对MGC-803肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用。
(3)红芪多糖的抗肿瘤作用与其结构密切相关,葡聚糖HPS-1和杂多糖HPS-3是极具潜力的抗肿瘤活性成分。
(4)HPS-3可阻滞细胞于G2/M期,诱导细胞凋亡,此作用可能是通过影响Bcl-2的表达,活化Caspase-3产生的。