【摘 要】
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红曲霉在我国具有悠久的应用历史,河南裴李岗遗址发现距今约8000年前的红曲霉酿酒。红曲霉应用广泛,其次级代谢产物红曲红是目前世界上仅有的一种利用微生物发酵生产的天然功能性食用色素。近年来随着分子生物学的发展,研究表明红曲霉产生真菌毒素桔霉素,过量摄入含有桔霉素的食品会严重损害哺乳动物的肾脏器官。正是由于桔霉素的毒害性,严重制约了红曲制品的发展。但是目前为止对于红曲霉产桔霉素的机制尚不清楚,本研究通
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红曲霉在我国具有悠久的应用历史,河南裴李岗遗址发现距今约8000年前的红曲霉酿酒。红曲霉应用广泛,其次级代谢产物红曲红是目前世界上仅有的一种利用微生物发酵生产的天然功能性食用色素。近年来随着分子生物学的发展,研究表明红曲霉产生真菌毒素桔霉素,过量摄入含有桔霉素的食品会严重损害哺乳动物的肾脏器官。正是由于桔霉素的毒害性,严重制约了红曲制品的发展。但是目前为止对于红曲霉产桔霉素的机制尚不清楚,本研究通过荧光共定位为桔霉素在红曲霉内合成、转运途径提供了一定的理论依据。为详细了解桔霉素合成蛋白在红曲霉菌丝内定位,我们选取了桔霉素合成基因簇中的ctn E、ctn H、orf1和orf5基因进行研究,成功构建了桔霉素基因与m Cherry融合表达载体,并采用根癌农杆菌介导转化的方法将桔霉素合成基因转入橙色红曲霉AS3.4384::Rab6A。通过双荧光共定位系统观察表明,在橙色红曲霉菌丝内4种桔霉素合成蛋白和Rab6A介导的转运蛋白存在同样的囊泡状结构,且共定位效果明显,推测红曲霉内桔霉素合成运输与细胞内囊泡转运系统相关。摇瓶液态发酵产桔霉素分析表明,出发菌株橙色红曲霉AS3.4384::Rab6A过表达桔霉素合成基因均导致桔霉素产量的增加。过表达ctn E菌株的桔霉素产量相较于出发菌株提高了3.2倍;过表达ctn H和orf1菌株的桔霉素产量大致提高2.4倍;过表达orf5菌株的桔霉素产量提高了1.8倍。因此过表达桔霉素合成基因对红曲霉产桔霉素均具有促进作用。大米固态发酵产红曲色素分析表明,红曲霉过表达菌株色素产量均有不程度的降低。其中AS3.4384::Rab6A::ctn E和AS3.4384::Rab6A::ctn H菌株红曲色素产量分别减少64%和71%,由此可知,过表达ctn E和ctn H基因不利于红曲色素的产生;AS3.4384::Rab6A::orf1和AS3.4384::Rab6A::orf5菌株产红曲色素虽略有降低,但是经过统计学分析,红曲色素产量未有显著性差异,因此orf1和orf5基因不影响红曲色素的产生。荧光定量PCR分析表明,红曲霉过表达桔霉素合成基因导致红曲色素相关合成基因mpp A、mpp C和mpp E随培养时间的延长表达量增加;过表达ctn E和orf5基因导致红曲霉有性繁殖相关基因表达量增加。过表达orf1基因导致红曲霉无性繁殖相关基因表达量增加。过表达ctn H基因红曲霉生长相关基因无显著变化;出发菌株和过表达菌株内桔霉素合成相关基因pks CT和ctn A均随培养时间的延长表达量降低。因此,桔霉素合成基因不仅仅参与红曲霉内桔霉素合成,对红曲霉的生长发育及其它次级代谢产物存在重要的调控作用。本试验通过对桔霉素合成基因中的ctn E、ctn H、orf1和orf5基因亚细胞定位研究,为进一步了解桔霉素在红曲霉内的合成及转运提供帮助。
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