研究背景:哺乳动物组织中的细胞只有在充足的氧和营养物质的供应下,才能维持正常的新陈代谢,并将代谢后的产物排出体外。因此,组织细胞周围良好的血液循环是其新陈代谢活动的最基本的保证。各种原因造成的组织细胞周围血液的灌注量减少都会引起其发生由缺血引起的代谢活动的障碍,从而发生缺血性损伤。缺血性疾病治疗基本原则为恢复血液灌注以解除组织缺氧状态,从而阻止缺血性损伤的发展,恢复组织器官功能并修复损伤的组织结构。然而不论在临床还是动物实验中,却发现机体的组织细胞或者器官在周围血液灌注量发生减少或者中断一段时间,再次恢复血液供应,使得血液循环重新建立之后(即组织细胞或者器官周围的营养物质以及供氧重新恢复后),由于缺血引起的组织细胞或器官的代谢障碍以及结构破坏非但没有减轻,反而更加严重;甚至过长时间缺血再恢复血液灌注后,组织或器官会发生不可逆转的损伤,这种血液再灌注使得缺血性损伤更加加重的现象叫做缺血再灌注损伤。临床上无论由于各种原因的休克所致的全身组织缺血后再灌注的损伤,还有其它身体内一些重要的器官,如心脏、肝脏、肾脏、脑部、骨骼肌等局部发生缺血后再灌注引起的损伤都较为普遍存在。骨骼肌是对缺血十分敏感的组织之一,因此在临床上,骨骼肌缺血再灌注的现象最为常见。创伤、断肢再植、动脉移植术、骨筋膜室综合症、止血带使用时间过长、腹部主动脉瘤手术、原发性血栓的形成等都会导致严重的骨骼肌缺血再灌注现象的发生。近年研究发现,骨骼肌缺血再灌注的损伤不仅对局部器官造成损伤,而且局部器官的缺血再灌注引起的全身性炎症反应以及氧化应激反应使得远隔的器官甚至全身的多脏器均会发生较为严重的损伤。因此无论是在临床还是动物实验中,越来越重视对骨骼肌缺血再灌注损伤发生机制的研究。目前越来越多的研究发现,氧化应激以及炎症反应在缺血再灌注后的器官损伤中发挥重要作用。氧化应激反应是指由于自由基的产生增多而引起的体内细胞、分子和机体发生损伤。外层轨道中的单电子的原子、原子团被称为自由基,主要由活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)以及活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)两部分组成。正常情况下,机体内新陈代谢会不断地产生氧自由基,同时又不断地将其清除,因此氧自由基维持在一个动态平衡且较低的浓度。ROS是细胞在有氧代谢的过程中产生的高生物活性的含氧化合物或者外源性的氧化剂,它的产生与细胞抗氧化能力的失衡会引起氧化应激的反应。ROS在正常细胞和组织中的含量较少,是主要存在于线粒体中的细胞代谢副产物,参与细胞生长、分化等一系列生理活动,也可以抵御微生物病原体的入侵。细胞内XO是ROS形成的主要来源,当细胞发生氧化应激反应时,XO和次XO基质物大量堆积并代谢,随之与乳酸、丙酮酸和葡萄糖等共同作用,生成ROS,并且氧化应激的作用也会引起ROS直接作用的氨基酸改变引起多种蛋白质功能发生变化。氧自由基不仅能氧化细胞磷脂双分子层结构的重要脂类生成脂质过氧化物,直接损伤细胞,还会引起血小板在微血管中的聚集和粘附,造成微循环的障碍。不仅如此,ROS还会进一步诱导细胞的凋亡,目前多种研究表明,器官的缺血再灌注后的损伤可能与短时间地暴露于高浓度的ROS有关。当组织或细胞在低氧或缺氧的环境下会消耗大量的ATP,促使机体产生高浓度的ROS,脂质过氧化是引起ROS介导的缺血再灌注损伤的主要机制,即ROS攻击细胞磷脂双分子层以及细胞膜表面各种酶的多不饱和脂肪酸的侧链进一步产生过量的脂类过氧化物,从而改变细胞膜的通透性,最终会破坏组织细胞膜的完整性,甚至使细胞的代谢功能也发生障碍。同时超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性显著降低,加重了缺血再灌注后的过氧化反应,进一步引起器官或组织的损伤,而SOD是体内重要的抗氧化酶,主要负责清除体内由于高浓度的ROS过度消耗的过多的自由基的活性。在缺血再灌注引起的肝脏、骨骼肌、脑组织和心肌组织损伤的研究中,氧化应激反应均被报道参与其中。炎症反应主要发生在缺血再灌注损伤的起始和扩大阶段,是引起缺血再灌注后损伤的重要因素。炎症的早期主要是以中性粒细胞浸润为主,而晚期则是以巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润为主。淋巴细胞在组织中的大量聚集不仅可以阻塞组织中的微循环、诱导损伤性的细胞因子的产生,同时白细胞在组织局部聚集后的群体呼吸效应也会诱导ROS在局部的大量生成。缺血再灌注损伤的特点主要是组织上皮细胞的坏死以及炎性细胞在局部坏死组织的高度浸润,同时细胞的粘附分子、趋化因子以及细胞因子均参与到缺血再灌注后炎症介导的组织损伤中。研究表明,当组织发生缺血缺氧后,氧化应激反应中过多的ROS会诱导核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的转录。NF-kB的转录可以促进多种炎性因子如IL-1,IL-6以及TNF-α的上调表达。这些炎性细胞因子可以通过自分泌、旁分泌以及体液途径以组织之间彼此形成调控网络、共同协作,进一步引起组织的损伤。TNF-α既可以直接对细胞的线粒体产生毒性作用来诱导细胞的坏死或凋亡,也可以间接地通过上调ROS的表达,加重缺血再灌注后的氧化应激反应。当TNF-α的活性受到抑制后可以明显地减轻脑部缺血再灌注后血脑屏障功能的紊乱与组织的坏死。IL-6作为一种促炎性的细胞因子,会增强粘附分子的表达,IL-1会诱导IL-8的合成并增强细胞粘附分子以及整合素的表达,从而增强白细胞与内皮细胞间的粘附分子,形成一种“正反馈”,进一步增强白细胞在损伤局部组织中的聚集,并合成更多的细胞因子,增强炎症介导的缺血再灌注损伤。叶黄素(Lutein)是绿叶蔬菜、鸡蛋以及水果色素的主要组成成分,广泛存在于自然界中,是含氧类胡萝卜素的一种,Lutein在血清、肝脏、脂肪和视网膜中的含量较高。Lutein(C40H56O2)的氧化基团会与自由基发生反应,具有较强的抗氧化的作用。此外Lutein的氧化产物也可以表现出很强的清除体内自由基的活力,并且Lutein或其产物的含量越高,清除自由基的能力也相应增强。同时Lutein在食物中的摄取可以显著升高SOD、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathoine peroxidase,GPx)以及还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平,拮抗体内过多生成的ROS。Lutein被报道可以参与维持眼部的健康,减轻年龄相关的黄斑降解,并且具有很强的抗氧化应激反应的作用。Lutein可以通过抑制炎症反应来防止动脉粥样硬化、紫外线诱导的皮肤炎症,以及脂多糖诱导的巨噬细胞炎症的发生。最近报道发现,作为一种有效的抗氧化应激和炎症反应的化合物,Lutein可以有效地减轻小肠以及肾脏缺血再灌注损伤的发生。目前,未见对Lutein参与减轻骨骼肌缺血再灌注损伤方面的研究,本项目拟对Lutein是否参与减轻骨骼肌缺血再灌注损伤以及可能的机制予以研究。研究目的:通过构建大鼠骨骼肌缺血再灌注模型,观察并探究:(1)Lutein处理后大鼠骨骼肌病理结构的变化以及炎性细胞的浸润,判断Lutein是否可以减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注后的损伤。(2)Lutein处理后大鼠骨骼肌中脂类过氧化物质丙二醛(maleic diadehyde,MDA)、蛋白羰基化和巯基化水平,ROS的含量以及介导氧化应激反应的关键转录因子核因子相关因子-2(nuclear related factor-2,Nrf-2)的表达水平,探究Lutein在大鼠骨骼肌缺血再灌注模型中是否可以降低氧化应激反应。(3)Lutein处理后是否可以增强大鼠骨骼肌中谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)、GPx、CAT、SOD 活性以及 GSH 含量,探究Lutein在大鼠骨骼肌缺血再灌注模型中是否可以增加机体抗氧化水平。(4)Lutein处理再灌注后大鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-lβ以及TNF-α的变化,转录因子COX-2以及NF-κB的表达水平,探究Lutein在大鼠骨骼肌缺血再灌注模型中是否可以降低炎症反应。研究方法:50只重量250～275 g雄性Wistar大鼠,按随机数字表随机分为5组,每组10只。利用无创血管夹构建大鼠缺血再灌注模型,总实验时间为6 hr;Lutein 0.5 mg/Kg溶于200μl注射用茶油,备腹腔注射用。假手术(Sham)组:大鼠麻醉后只相应的暴露双侧股动脉,未用无创动脉夹对股动脉进行夹闭。假手术+ Lutein(Sham+L)组:手术方式同Sham组,实验结束前3 hr腹腔注射Lutein溶液200μl。缺血再灌注(I/R)组:大鼠麻醉后暴露股动脉,缺血4 hr后再灌注2 hr;于再灌注前1 hr(即实验结束前3 hr)腹腔注射生理盐水200μl。缺血再灌注油剂(I/R+O)组:大鼠麻醉后暴露股动脉,缺血4 hr后再灌注2 hr;于再灌注前1 hr腹腔注射注射用茶油200μl。缺血再灌注+ Lutein(I/R+L)组:大鼠麻醉后暴露股动脉,缺血4 hr后再灌注2 hr;于再灌注前1 hr腹腔注射Lutein溶液200μl。实验完成后取大鼠的骨骼肌标本,通过组织病理切片以及H&E染色方法检测Lutein减轻大鼠骨骼肌病理损伤的情况;分析氧化应激反应相关的指标(ROS生成量,蛋白羰基化水平、蛋白巯基化以及MDA含量),抗氧化指标(GST活性、GPx活性、CAT活性、SOD活性、总GSH含量);Western blot方法检测Nrf-2、NF-κB以及COX-2水平的表达;ELISA方法检测血清中IL-6,IL-lβ以及TNF-α的含量。研究结果:(1)在骨骼肌病理检测方面,与Sham组相比,I/R及I/R+O组病理损伤显著加重,局部肌纤维排列紊乱,间质出现明显的水肿,并出现中性粒细胞、淋巴细胞浸润;I/R+L组白细胞在组织血管中的浸润程度显著减少,虽然肌纤维的间隙出现一定程度的增宽,在局部结构中可见少量的肌纤维发生变性与水肿,骨骼肌的结构基本完整;上述的病理检测结果在Sham+L组与Sham组无明显区别,I/R+O组与I/R组无明显区别。(2)相比于Sham组,I/R及I/R+O组中ROS的含量显著增加(P<0.001),MDA的含量显著增加(P<0.001),蛋白羰基化水平与蛋白巯基化水平显著上调(P<0.001);相比I/R组,I/R+L组可以显著降低组织中ROS的含量(P<0.001)以及MDA的含量(P<0.001),下调蛋白羰基化(P<0.01)以及蛋白巯基化水平(P<0.001);上述指标在Sham+L组与Sham组无明显区别,I/R+O组与I/R组无明显区别。(3)相比于Sham组,I/R及I/R+O组骨骼肌GSH含量显著降低(P<0.001),SOD活性、CAT活性、GST活性以及GPx活性显著下调(依次是P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.01),转录因子Nrf-2的表达水平显著降低(P<0.001);相比I/R组,I/R+L组可以显著增加骨骼肌中GSH含量,上调SOD、CAT、GST以及GPx的活性(依次是 P<0.001,P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.01),显著提高 Nrf-2 的表达水平(P<0.001);上述指标在Sham+L组与Sham组无明显区别,I/R+O组与I/R组无明显区别。(4)相比于Sham组,I/R及I/R+O组血清中IL-6、IL-lβ以及TNF-α显著上调(P<0.001),NF-κB,COX-2的表达水平也相应地上调(P<0.001);I/R+L组可以显著地降低血清中IL-6,IL-1β以及TNF-α含量(依次是P<0.01,P<0.01,P<0.001)以及NF-κB、COX-2的表达水平(P<0.001);上述指标在Sham+L组与Sham组无明显区别,I/R+O组与I/R组无明显区别。研究结论:叶黄素减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注后损伤的机制包括:(1)减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注后骨骼肌的病理损伤以及炎性细胞的浸润。(2)降低大鼠骨骼肌缺血再灌注后氧化应激反应,通过降低氧化应激反应的相关指标(ROS生成量,蛋白羰基化水平、蛋白巯基化以及MDA含量)。(3)提高大鼠骨骼肌缺血再灌注后抗氧化应答,其机制可能与增加GSH含量、增强抗氧化酶活性(GST、GPx、CAT和SOD)以及上调核内Nrf-2蛋白的表达有关。(4)降低大鼠骨骼肌缺血再灌注后的炎症应答反应,其机制可能与下调炎性细胞因子(IL-6、IL-lβ和TNF-α)的表达以及抑制相关炎性基因的转录(下调COX-2蛋白和核内NF-κB蛋白的表达)有关。