糖尿病肾病是糖尿病重要的微血管病变,也是导致终末期肾病(endstageof renaldisease,ESRD)的重要因素之一。肾小球硬化以及肾小管纤维化是糖尿病肾病的主要病理特征,而其中的肾小球足细胞损伤是糖尿病肾病的早期事件。足细胞是一种高度分化的肾脏实质细胞,它与肾小球内皮细胞、肾小球基底膜共同构成了肾小球滤过屏障。多种病因均可以导致足细胞的损伤,诱导足细胞足突融合与消除、进而引起足细胞凋亡及脱落,最终导致肾小球滤过屏障完整性被破坏和蛋白尿生成。临床上,多种肾病的发生发展中均出现足细胞损伤并伴随着蛋白尿的产生,如糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)、膜性肾病(membranous glomerulonephritis,MGN)、IgA型肾病。由于足细胞本身具有非常有限的修复和再生能力,因此,足细胞损伤的程度常被作为这些相关肾病重要的预后指标之一。所以,寻找具有足细胞保护作用的靶点,对于改善足细胞损伤,诊断与治疗蛋白尿相关肾病具有非常重要的意义。近些年,以乙酰化修饰为代表的表观遗传学在肾脏中的作用越来越受到广泛的关注。乙酰化修饰是有组蛋白乙酰转移酶(histone acetyl transferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)共同调控的,其中组蛋白去乙酰化酶有四个亚家族构成:Ⅰ类、Ⅱ类及Ⅳ类亚家族是Zn2+依赖型的,而Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶是NAD+依赖型的(Sirtuin,SIRTs)。实验室前期研究发现在Zn2+依赖型的组蛋白去乙酰化酶中,HDAC4可以促进糖尿病肾病中足细胞的损伤。但SIRTs在肾脏中的研究主要集中于Sirtl,但SIRTs家族的其他成员在肾脏中的作用尚不明确,因此系统性研究SIRTs家族成员在肾脏以及足细胞中的作用及调控机制对于发现潜在的蛋白尿相关肾病的治疗靶点具有重要的意义。研究目的1、探究SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式,明确Sirt1-7各亚型是否参与糖尿病肾病的发生与发展以及足细胞的损伤。2、阐明Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用。3、探讨Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制。研究方法第一部分:SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式1.1在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中检测SIRTs家族各成员的表达变化:通过单肾切除后腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)构建糖尿病肾病小鼠模型模型。利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测Sirtl-7在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中蛋白表达变化。1.2.利用临床标本探究Sirt6在足细胞损伤相关肾病病人肾活检标本中的蛋白表达情况及其与肾小球率过滤(glomerular filtration rate,GFR)、蛋白尿的相关性分析:利用免疫组化方法(immunohistochemistry,IHC)检测糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病及IgA型肾病病人肾活检标本中Sirt6的蛋白表达变化。实时定量RT-PCR进一步确定Sirt6在糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病及IgA型肾病病人肾脏中mRNA表达变化。进一步对足细胞损伤相关肾病病人肾脏中Sirt6的mRNA水平与病人肾小球率过滤及蛋白尿水平进行相关性分析。1.3.在体外培养的人源足细胞(human podocyte,HPC)中检测不同刺激下Sirt6的蛋白表达变化:体外培养人源足细胞,分别给予高糖(highglucose,HG)和糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGE)刺激24小时后,抽提细胞内蛋白,进行蛋白免疫印迹分析,检测在不同刺激下Sirt6在HPC中的蛋白表达变化。第二部分:Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1足细胞特异性敲除Srit6的小鼠的构建及表型观察:利用Cre-Loxp系统构建足细胞特异性敲除Srit6的小鼠,通过鼠尾DNA提取后的基因型鉴定确证特异性敲除小鼠的构建成功;接下来利用免疫荧光双标法进一步观察敲除小鼠肾脏石蜡切片中足细胞内Sirt6的蛋白表达水平;另外,利用肾小球分离技术对敲除小鼠进行肾小球分离,然后采用蛋白免疫印迹检测肾小球内Sirt6的蛋白表达水平,进一步在蛋白水平上对Sirt6敲除效率进行评价。首先取不同年龄段(6月,9月,12月)小鼠血清及尿液进行分析,比较基因敲除小鼠与野生型小鼠蛋白尿水平的差异。利用肾脏石蜡切片进行过碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS),观察不同年龄段基因敲除小鼠与野生型小鼠肾小球形态学差异。利用电子显微镜对不同年龄段的小鼠足细胞形态进行观察。2.2敲除足细胞Sirt6对糖尿病肾病小鼠足细胞以及蛋白尿的影响:首先取小鼠血清及尿液进行分析,比较糖尿病肾病基因敲除小鼠与野生型小鼠蛋白尿水平的差异。利用过碘酸雪夫氏染色观察不同处理组基因敲除小鼠与野生型小鼠肾小球形态学差异。利用电子显微镜对不同处理组基因敲除小鼠与野生型小鼠足细胞形态进行观察。通过免疫荧光染色观察不同处理组基因敲除小鼠与野生型小鼠足细胞特异性蛋白Nephrin和Podocin染色形态及蛋白表达水平;并进一步观察足细胞内尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)蛋白表达水平的变化。2.3体外研究Sirt6对高糖(HG)刺激下的足细胞的保护作用:体外研究中,我们利用Sirt6腺病毒转染HPC,实现HPC内Sirt6蛋白高表达。首先通过荧光实时定量RT-PCR检测在HG刺激下,过表达Sirt6对HPC中炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA水平的影响。其次,采用流式细胞术检测过表达Sirt6对HPC细胞凋亡的影响。接下来,通过免疫荧光方法观察过表达Sirt6对HPC的细胞骨架形态的影响。最后,通过蛋白免疫印迹方法检测过表达Sirt6后对自噬相关蛋白LC3、Beclin等蛋白表达水平的调控;采用腺病毒作为载体的GFP-LC3-RFP质粒转染足细胞,检测过表达Sirt6对足细胞自噬流的影响;电镜观察过表达Sirt6对HG刺激下HPC自噬小体数量的影响。第三部分:Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制3.1检测足细胞内Sirt6对H3K9位点的乙酰化水平的调控:免疫组化方法观察糖尿病肾病病人以及局灶性节段性肾小球硬化症病人的肾活检标本中H3K9乙酰化水平的变化。免疫荧光双标实验继续观察足细胞敲除Sirt6糖尿病肾病小鼠足细胞内H3K9乙酰化水平的变化。体外研究中,利用蛋白免疫印迹方法检测过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中H3K9ac的影响。3.2足细胞内Sirt6对Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1表达水平的调控:利用基因芯片筛选Sirt6的下游靶基因,通过荧光实时定量RT-PCR进一步确认过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中Notch1和Notch4的mRNA水平的调控。利用蛋白免疫印迹的方法观察敲除HPC内的Sirt6后,Notch1和Notch4的蛋白水平是否发生上调。免疫荧光双标实验在体内水平检测足细胞内敲除Sirt6后糖尿病肾病小鼠足细胞内Notch1和Notch4的蛋白水平的影响。进一步对Notch信号通路的下游靶基因HES1和Snail1进行检测,通过免疫荧光双标实验在体内水平检测足细胞内敲除Sirt6后糖尿病肾病小鼠足细胞内HES1和Snail1的蛋白水平的影响,同时结合体外研究利用荧光实时定量RT-PCR进一步确认过表达Sirt6或加入Notch信号通路抑制剂DAPT后对HG刺激下HPC中HES1和Snail1的mRNA水平的调控。3.3足细胞中Sirt6通过调控H3K9的乙酰化水平影响Notch1和Notch4转录:采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)方法检测Notch1和Notch4启动子是否位于H3K9位点,同时观察过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中Notch1和Notch4启动子区域H3K9位点乙酰化水平的调控。利用ChIP方法检测Sirt6与Notch1和Notch4启动子区域是否存在结合以及它们之间的结合在不同刺激下是否发生改变。3.4 Sirt6所调控的Notch信号通路参与足细胞保护作用:首先,通过荧光实时定量RT-PCR检测、Notch信号通路抑制剂DAPT后是否可以调控HG刺激或敲除Sirt6后的HPC中炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA水平的影响。流式细胞术继续观察DAPT是否可以抑制HG刺激或敲除Sirt6后的细胞凋亡。免疫荧光方法进一步探究DAPT是否可以抑制HG刺激或敲除Sirt6后的细胞骨架重排。其次,通过蛋白免疫印迹方法检测敲除Notch1后对Sirt6沉默后HPC中自噬相关蛋白Atg5等蛋白表达水平的调控,利用GFP-LC3-RFP质粒转染足细胞并检测敲除Notch1后对Sirt6沉默后HPC中自噬流的影响。研究结果第一部分:SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式1.1在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中Sirt1和Sirt6蛋白水平明显下降:蛋白免疫印迹结果表明在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中,Sirt1,Sirt3,Sirt4和Sirt6蛋白表达水平出现不同程度的降低,其中以Sirt 1和Sirt6下降最明显。1.2 Sirt6在足细胞损伤相关肾病病人肾活检标本中的表达都出现明显下调,并且与肾小球率过滤、蛋白尿的生成密切相关:免疫组化结果显示在糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病及IgA型肾病病人肾活检标本中Sirt6的蛋白表达水平均出现明显下调。同时实时定量RT-PCR进一步确定Sirt6糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病及IgA型肾病病人肾脏中mRNA水平明显下降。相关性分析结果表明足细胞损伤相关肾病病人肾脏中Sirt6的mRNA水平与病人肾小球率过滤呈正相关,而与蛋白尿水平呈负相关。1.3在不同刺激下的HPC中,Sirt6蛋白表达水平都显著降低:蛋白免疫印迹表明,HG与AGE都可以显著诱导HPC中的Sirt6蛋白表达水平显著下调。第二部分:Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1足细胞特异性敲除Srit6的小鼠的构建及表型观察:鼠尾DNA提取后的基因型鉴定确证足细胞特异性敲除小鼠的构建成功;免疫荧光双标实验进一步确认敲除小鼠足细胞内Sirt6的蛋白表达明显降低;蛋白免疫印迹结果发现肾小球内Sirt6的蛋白表达水平显著下调。不同年龄段(6月,9月,12月)的小鼠进行表型观察,发现在出生后的前9个月内,基因敲除小鼠与野生型小鼠之间没有明显的差异。但在出生后12个月后,与野生型小鼠比较,基因敲除小鼠出现轻微蛋白尿;PAS染色发现基因敲除小鼠肾小球中出现系膜增生;电镜结果进一步清晰观察到在基因敲除小鼠的足细胞中,足突出现融合,数量减少,同时肾小球基底膜出现明显增厚。此外,免疫荧光染色实验结果也表明Sirt6敲除小鼠足细胞内特异性蛋白Nephrin和Podocin蛋白水平显著下降。2.2敲除足细胞内Sirt6加重糖尿病肾病小鼠足细胞损伤:敲除足细胞内的Sirt6可以使糖尿病肾病小鼠蛋白尿水平进一步上升,加重肾小球系膜增生、足细胞足突的融合、足突数量的减少及肾小球基底膜的增厚。同时研究发现敲除Sirt6会进一步下调糖尿病肾病小鼠足细胞内Nephrin,Podocin蛋白表达水平,上调uPAR的蛋白表达水平。2.3 Sirt6通过多重保护作用改善足细胞损伤:体外研究发现过表达Sirt6可以抑制HG刺激足细胞所引起的IL-1β等炎性相关因子水平的升高,降低足细胞凋亡,改善足细胞骨架重排。另外,我们还发现Sirt6可以显著恢复足细胞内的自噬水平,抑制HG刺激所引起的自噬水平的降低。第三部分:Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制3.1足细胞内Sirt6可以调控H3K9位点的乙酰化水平:免疫组化结果发现糖尿病肾病病人以及局灶性节段性肾小球硬化症病人的肾活检标本中H3K9位点乙酰化水平明显升高。免疫荧光实验显示足细胞敲除Sirt6后会进一步上调糖尿病肾病小鼠足细胞内H3K9位点的乙酰化水平。另外,蛋白免疫印迹结果表明过表达Sirt6后可以显著的下调HG刺激足细胞所引起的H3K9ac水平的升高。3.2 Sirt6可以反向调控Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1的表达:基因芯片结果提示Sirt6蛋白水平的下调可能参与HG刺激的足细胞内Notch信号通路的激活。荧光实时定量RT-PCR进一步确认过表达Sirt6后可以抑制HG刺激HPC中Notch1和Notch4的mRNA水平的上调。体外研究发现敲低HPC内的Sirt6后,Notch1和Notch4的蛋白水平显著上调;体内研究进一步确认足细胞特异性敲除Sirt6后,糖尿病肾病小鼠足细胞内Notch1和Notch4的蛋白水平明显升高。在Notch信号通路下游靶基因的研究中发现,敲除足细胞Sirt6会上调糖尿病肾病小鼠足细胞内HES1和Snail1的蛋白水平。荧光实时定量RT-PCR发现过表达Sirt6或加入Notch信号通路抑制剂DAPT后均可以降低HG刺激下HPC 中 HES1 和 Snail1 的 mRNA 水平。3.3 Sirt6通过调控H3K9位点乙酰化水平影响Notch1和Notch4转录:首先ChIP结果发现HG刺激下HPC中Notch1和Notch4启动子区域H3K9位点乙酰化水平出现明显升高,过表达Sirt6可以抑制H3K9位点乙酰化水平的上调。其次,我们通过ChIP研究发现Sirt6与Notch1和Notch4启动子区域存在结合,这种结合在HG刺激下明显减少,过表达Sirt6后能够得以恢复。3.4 Sirt6所调控的Notch信号通路参与其足细胞保护作用:DAPT可以明显抑制HG刺激或敲除Sirt6后的HPC中炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNFα水平的升高以及足细胞凋亡,并且改善细胞骨架重排。蛋白免疫印迹结果表明敲除Notch1后可以明显恢复Sirt6沉默后HPC中自噬相关蛋白Atg5等蛋白表达水平的下调,提高足细胞自噬水平。结论及创新性1.Sirt6的水平在足细胞损伤肾病病人肾脏中出现明显下降,并且相关性分析发现Sirt6的mRNA水平与病人肾小球滤过率呈正相关,与蛋白尿水平呈负相关。2.特异性敲除足细胞内的Sirt6后显著加重糖尿病肾病小鼠足细胞的损伤以及蛋白尿的生成,并进一步发现Sirt6可以通过抗炎症、抗凋亡、抑制足细胞骨架重排及提高足细胞自噬水平作用改善HG诱导的足细胞损伤。3.在Sirt6足细胞保护作用机制的研究中,我们发现Sirt6可以通过降低H3K9位点的乙酰化水平,抑制Notch家族中Notch1和Notch4的转录及下游信号通路的激活,继而发挥足细胞保护作用4.本实课题首次发现Sirt6可以通过靶向调控Notch信号通路改善糖尿病肾病中足细胞损伤,降低蛋白尿的生成,为Sirt6下游作用机制提供的思路,同时为寻找糖尿病肾病提供了新的治疗靶点与实验基础。