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Stk40是一个含有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的蛋白。本课题组以前的研究表明该蛋白可以通过激活Erk/MAPK通路诱导小鼠胚胎干细胞向胚外内胚层细胞分化。为了阐明Stk40基因的生理功能，我们利用基因同源重组技术构建了Stk40敲除小鼠模型。 Stk40基因缺失的纯合子小鼠（Knock out，KO，Stk40-/-）在出生后数小时之内死亡，而杂合子小鼠（Heterzygote，Het, Stk40+-）则没有发现异常表型，与野生型小鼠(Wild type，WT, Stk40+/+)一样可以正常生长、发育和繁殖。解剖检查出生前后的胚胎发现，Stk40+/+小鼠胚胎本身及多个器官，包括肾脏、肺、肝脏和脾脏都较正常胚胎显著减小。Stk40-/-小鼠的脾脏和胎肝明显减小，发白，并伴随外周血轻度贫血。所以，Stk40基因缺失引起的多器官发育异常暗示该基因在小鼠的胚胎阶段的肾脏、肺、脾脏和胎肝等器官发育和胚胎阶段脾脏和胎肝造血中有可能有重要的作用。 Stk40-/-小鼠出生后能够做出自主呼吸动作。但是，出现呼吸窘迫、皮肤青紫现象，在数小时内死亡。解剖发现死亡小鼠的肺部无空气进入，沉水实验中全部沉入水底。出生后小鼠尸检发现Stk40-/-小鼠肺不张，伴随有充血现象。因此，我们推测，Stk40基因敲除小鼠死亡的主要原因可能是肺发育异常引起的呼吸衰竭。组织学检测E18.5天的胚胎，证实Stk40-/-胚胎的肺脏成熟滞后，糖原含量多于正常肺脏。此外，肺泡间隔增厚，肺泡扩张不足。Stk40-/-小鼠肺部Ⅱ型肺泡上皮细胞不成熟，表面活性蛋白SP-B和SP-C表达减少。Ⅰ型细胞数量减少，标记基因T1-α的表达量明显减少。因此，我们推测，Stk40的缺失，影响了肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞的成熟，导致肺泡上皮表面活性物质合成减少和肺功能不全。荧光定量RT-PCR检查发现在成体和胚胎阶段的各个脏器中，Stk40的mRNA水平在肺脏中最高。通过全基因组芯片比较发现在Stk40-/-小鼠肺中共有763个基因显著改变(P＜0.05，FC＞1.5)，其中319个基因表达下降，444个基因表达增加。其中有30多个差异基因已知参与肺发育，包括C/EBPα、FGF-18、Shh、Pref-1/Dlk-1和Wnt2等。以上结果说明Stk40参与肺部发育基因的调控，对肺脏的发育和功能都有重要的作用 由于Stk40基因缺失小鼠全部在出生时死亡，我们无法研究该基因在出生后至成体中的的生理功能。取自胚胎E12.5-E14.5天的胚胎成纤维细胞（MEF细胞，mouse embryonic fibroblast）不仅是研究基因在细胞水平的功能或分子水平的调控机制的理想模型，也是一个具有一定间充质(Mesenchymal)分化潜能的的细胞群体。我们意外地发现取自Stk40-/-胚胎的MEF细胞在正常培养条件下有少量细胞能够自发地分化为脂肪细胞，所以我们利用MEF细胞研究了Stk40对脂肪分化的调控。发现在诱导脂肪分化条件下，Stk40-/-MEF细胞分化为含有脂肪油滴的脂肪细胞的比例和程度都显著地高于Stk40+/+MEF细胞。脂肪特异的重要转录因子和标记基因在mRNA和蛋白水平都显著提高，包括C/EBPα、PPARγ和aP2。在同样的诱导条件下，只有少量Stk40+/+MEF细胞发生了脂肪分化。这些发现提示Stk40参与脂肪细胞的分化调控。 为了阐明Stk40是如何参与脂肪分化调控，我们进一步检查了已知调控脂肪分化的重要的胞外信号通路和胞内转录因子的表达情况。在Stk40-/-MEF细胞中，早期促进脂肪分化的信号通路，如Erk/MAPK和PI3K-Akt，和转录因子，如C/EBPβ、C/EBPδ、K1f5和Krox20的mRNA表达水平均显著降低。但是，不论在未分化和分化状态下，Stk40-/-MEF细胞中C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白质水平却都要高于Stk40+/+MEF细胞。另外，当我们将Stk40在Stk40-/-MEF细胞中重新表达，脂肪分化受到明显抑制。检测发现Stk40的过表达使得C/EBPβ和C/EBPδ的转录水平略有增加，而C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平却明显降低。说明Stk40可能是通过在转录后水平调控转录因子C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平，从而抑制脂肪细胞的分化。 蛋白质泛素化修饰是翻译后调控蛋白质水平的重要途径。我们用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理MEF细胞可以大幅提高C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平，可见细胞内C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白质水平受26S蛋白酶体降解途径的调控。但是，抑制蛋白酶体不能消除Stk40+/+和Stk40-/-MEF细胞间C/EBP的蛋白水平差异，说明Stk40可能不是通过蛋白降解途径来降低C/EBP的蛋白水平。此外，我们用放线菌酮CHX抑制蛋白质的合成，发现C/EBPβ和C/EBPδ的降解速率在Stk40+/+和Stk40-/-的MEF细胞之间没有明显差异。这样，Stk40可能不是通过控制蛋白质的稳定性实现对C/EBP蛋白质水平的调节，而是可能通过miRNA或其它蛋白翻译相关的途径影响C/EBP蛋白的合成从而抑制脂肪细胞的分化。目前，我们尚不能确定Stk40是如何调控C/EBP蛋白的合成。进一步的研究有望阐明Stk40负调节C/EBP蛋白水平的分子机制。 综上所述，我们的研究首次报道了Stk40基因的敲除小鼠模型，并发现该基因对小鼠的胚胎发育和器官功能具有重要的作用。Stk40突变小鼠在出生时迅速死亡，肺脏发育异常导致不能呼吸可能是死亡的直接原因。肝脏、脾脏发育异常提示Stk40对于胚胎阶段造血具有重要的作用。MEF细胞的脂肪分化研究显示Stk40通过转录后水平调控C/EBPβ和C/EBPδ等重要转录因子的蛋白质水平来参与脂肪分化的调控，并且可能在肥胖和肥胖引起的代谢性疾病中发挥有重要的作用。这些发现对于揭示Stk40的生理功能有重要的贡献。同时，Stk40基因敲除小鼠为研究多个器官发育调控提供了方便的体内模型。进一步利用Stk40条件性敲出小鼠的研究将更加有助于我们全面阐明Stk40在胚胎发育以及成年鼠中的生理功能。