新疆一枝蒿抗病毒有效组分及其药理作用研究

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一枝蒿(Artemisia rupestris L.),菊科(Compositae)蒿属植物岩蒿的全草,广泛分布于中国新疆,中亚,欧洲等地。一枝蒿是维吾尔医常用药材,具有解毒、健胃消食、抗过敏、抗菌、抗病毒及保肝等功效,主要用于治疗感冒、咽炎、荨麻诊及肝炎等症。为了更深入的了解一枝蒿药效作用的物质基础,以及更好的开发这一新疆传统药材,本论文对新疆一枝蒿抗病毒有效部位的制备工艺、化学成分分析、质量标准以及抗流感病毒和抑菌活性进行了系统研究。具体研究内容如下:  1.新疆一枝蒿抗病毒有效部位提取纯化富集工艺的研究  以一枝蒿酮酸、总黄酮及出膏率为指标,对新疆一枝蒿抗病毒有效部位的提取纯化工艺进行研究。通过单因素实验和正交试验,确定了新疆一枝蒿抗病毒有效部位的最佳提取条件,即料液比为14倍、70%乙醇溶液在80℃温度下将新疆一枝蒿药材提取2次,每次2小时,合并滤液。按照优化的提取工艺提取测得新疆一枝蒿有效部位中总黄酮含量为12.58%,一枝蒿酮酸平均含量为1.38%,而原药材中总黄酮含量为1%,一枝蒿酮酸平均含量为0.3%,该方法操作简便、工艺稳定可靠。  在提取工艺的基础上,考察了8种不同极性的大孔树脂对一枝蒿酮酸和总黄酮的静态吸附及解析能力,筛选出HPD450型为其最佳大孔吸附树脂。通过考察最佳上样浓度、上样流速、最大上样量、除杂溶液用量和洗脱乙醇浓度及用量等工艺参数,确定了新疆一枝蒿抗病毒有效部位的富集纯化工艺为:上样浓度为0.2g/mL溶液,以2BV/h吸附速率进行吸附,上样量6BV时接近饱和,4BV纯化水除杂,再分别以4BV柱体积30%乙醇和3BV柱体积70%乙醇洗脱,合并乙醇洗脱液,减压浓缩,浸膏真空干燥,粉碎过80目筛,即得该有效部位。经过该富集方法纯化后的有效部位中,总黄酮的含量为22.82%,一枝蒿酮酸的含量为7.19%,与原药材中总黄酮和一枝蒿酮酸的含量相比,均得到了很大的提高。  2.新疆一枝蒿有效部位的化学成分分析和质量标准研究  采用HPLC-QTOF-MS/MS技术,结合制各型高效液相色谱等分离技术和NMR等结构鉴定方法,从新疆一枝蒿有效部位中鉴定出60个化合物。质谱研究发现,一枝蒿有效部位的大孔树脂30%乙醇洗脱部位的主要成分为黄酮苷类和绿原酸类化合物;而70%乙醇洗脱部位中主要含有倍半萜类、黄酮苷元及色原酮类化合。通过大孔树脂、制备液相色谱等分离纯化手段,从一枝蒿有效部位中分离纯化了6个化合物,通过核磁波谱解析和质谱,确定其结构为金腰素乙(54)、一枝蒿酮酸(34)、芹菜素-6,8-C-二-β-D-葡萄糖苷(1)、3,5-二咖啡酰基奎宁酸(19)、5,4-二羟基-3,5-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷(25)和5,4-二羟基-3-甲氧基-7-O-葡萄糖醛酸苷(26)。利用高效液相色谱分析技术,通过与标准品在HPLC-DAD中保留时间与紫外光谱的比对,指认了该有效部位中的包含主要成分在内的15种化学成分,并同时对其中9个成分进行了含量测定。结果表明,经纯化之后9个成分含量从原药材中的0.57%提高到20%,主要成分在有效部位中得以有效富集,含量有明显的提高。  同时,建立了新疆一枝蒿抗病毒有效部位的质量标准,建立了原料药中一枝蒿酮酸、蒙花苷的薄层色谱鉴别方法和高效液相色谱(HPLC)含量测定的方法;通过紫外分光光度法建立了总黄酮的含量测定方法。本研究建立的方法简便、稳定、专属性强,为新疆一枝蒿抗病毒有效部位的质量控制提供了科学依据。  3.新疆一枝蒿抗病毒有效部位的药理作用研究  对新疆一枝蒿有效部位的体内、外抗流感病毒和抑菌生物活性进行了研究。一枝蒿有效部位的抑制甲型流感病毒的IC50为2.62μg·mL-1,小于利巴韦林组的IC50(8.15μg·mL-1),说明其具有显著的体外抑制甲型流感病毒作用。体内实验研究表明,与模型组比较,一枝蒿有效部位对PR8感染小鼠死亡具有显著的保护作用,并且可以显著延长感染小鼠的存活天数,存活时间随着给药剂量的增大而延长,说明一枝蒿有效部位在小鼠体内也具有较好的抗流感病毒作用。  抑菌实验发现,新疆一枝蒿有效部位对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的MIC分别为3.9 mg/mL和31.25 mg/mL,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌能力较强;此外,新疆一枝蒿有效部位中、大剂量组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染小鼠有一定的保护作用。
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