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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是由多种镰刀菌产生的一种具有雌激素效应的非类固醇真菌毒素,污染遍布全世界。ZEA对动物的毒性作用范围广泛,近年来人们对ZEA与雄性动物生殖能力下降存在密切关系的现象引起了关注,但相关机制不明。睾丸支持细胞在精子发生过程中起着不可替代的作用,因此,研究ZEA对睾丸支持细胞的毒性影响对揭示ZEA雄性动物生殖毒性的机理具有重要意义,并可以为ZEA毒性的防控提供理论依据。本研究以不同浓度的ZEA处理大鼠原代睾丸支持细胞建立体外毒性试验模型,利用透射电镜、流式细胞术和蛋白免疫印迹等技术,研究了 ZEA对睾丸支持细胞结构、凋亡率和凋亡相关蛋白的表达等影响,并探讨了 N-乙酰-半胱氨酸(NAC)在ZEA致睾丸支持细胞损伤中的保护作用。1.ZEA对睾丸支持细胞活力及超微结构的影响。用不同浓度ZEA(0、5、10、20、40μmol/L)处理大鼠原代睾丸支持细胞24h,CCK-8法检测ZEA对睾丸支持细胞活力影响,透射电镜观察睾丸支持细胞超微结构损伤。结果:与对照组相比,随着ZEA浓度的升高,各染毒组睾丸支持细胞活力均受到显著或极显著的抑制(P<0.05或P<0.01)。透射电镜观察显示,各染毒组细胞核出现核膜皱缩,染色质固缩趋边化、甚至片段化,线粒体肿胀、嵴断裂及空泡化加剧。说明ZEA对大鼠原代睾丸支持细胞有损伤作用,并存在剂量-效应关系。2.ZEA对睾丸支持细胞凋亡的影响。用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理大鼠原代睾丸支持细胞24h,AnnexinV-FITC/PI双染法检测凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡调控蛋白细胞色素C(CytC)、AIF的释放及Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表达量。结果:流式细胞术检测显示,与对照组相比,各染毒组细胞凋亡率呈现显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);Western Blot检测显示,线粒体中CytC呈现出在5μmol/LZEA处理组显著下降(P<0.05)和10、20μmol/LZEA处理组极显著下降(P<0.01);各染毒组线粒体中AIF均极显著下降(P<0.01);胞浆中CytC呈现出在10μmol/LZEA处理组显著上升(P<0.05)和20μmol/L ZEA处理组的极显著上升(P<0.01);10、20μmol/LZEA处理组胞浆中AIF呈极显著上升(P<0.01);cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表达量呈现显著或极显著的增加(P<0.05或P<0.01),而Bcl-2/Bax比值显著或极显著的降低(P<0.05或P<0.01)。表明ZEA能诱导睾丸支持细胞凋亡,caspase依赖性和caspase非依赖性的线粒体途径均参与了这一过程。3.ZEA对睾丸支持细胞氧化损伤的影响。用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理大鼠原代睾丸支持细胞24h,检测胞内SOD活性及MDA含量,流式细胞术检测ROS水平;装载JC-1探针,利用免疫荧光结合流式细胞术检测线粒体膜电位(Aψm)的变化。结果显示:与对照组比,SOD活力呈现出在1Oμmol/LZEA染毒组显著升高(P<0.05)和在2μmol/LZEA染毒组极显著升高(P<0.01);MDA含量在10μmol/L和20μmol/LZEA染毒组均呈现极显著升高(P<0.01);5μmol/LZEA染毒组ROS水平呈显著升高(P<0.05),10、20μmol/LZEA染毒组ROS水平呈现极显著升高(P<0.01);5μmo1/LZEA染毒组△ψm呈显著下降(P<0.05),10、20μmol/LZEA染毒组△ψm极显著下降(P<0.01)。说明ZEA诱导线粒体损伤的氧化应激机制与造成睾丸支持细胞的毒性密切相关。4.NAC对ZEA诱导睾丸支持凋亡中的保护作用。利用100μmol/L NAC与20μmol/L ZEA单独或联合处理睾丸支持细胞24h,AnnexinV-FITC/PI双染法检测凋亡率和ROS水平,Western Blot检测调控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、claved-caspase-9和claved-caspase-3表达量,比色法检测胞内SOD活性和MDA含量,JC-1探针检测线粒体膜电位变化。结果显示:与20μmol/LZEA单独处理组相比,100μmol/LNAC与20μmol/LZEA联合处理组睾丸支持细胞凋亡率、Bax、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表达量及ROS水平极显著降低(P<0.01);100μmol/L NAC与20μmol/LZEA联合处理组胞内SOD活力和MDA含量显著下降(P<0.05);100μmol/L NAC与20μmol/L ZEA联合处理组的△ψm和Bcl-2表达量极显著增高(P<0.01)。说明NAC可以降低ZEA对睾丸支持细胞氧化损伤作用,对ZEA诱导的睾丸支持细胞的凋亡发生起抑制作用。结论认为,ZEA可以造成睾丸支持细胞细胞核、线粒体等超微结构的损伤,诱导氧化应激和介导caspase依赖和caspase非依赖线粒体途径凋亡的发生。NAC通过降低氧化毒性损伤,对ZEA致睾丸支持细胞凋亡的发生起保护作用。