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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一种重要的动物疫病病原,牛感染后临床症状主要表现为腹泻、母畜流产和持续性感染等,造成重大的畜牧业经济损失。该病在全球范围内广泛分布,在我国20多个省、市、自治区都有流行。目前,研究人员对于BVDV感染的致病机制尚不清楚。小泛素样修饰(Small Ubiquitin-related Modifier,SUMO)是一种重要的蛋白质翻译后修饰,能对病毒蛋白进行调控,进而影响病毒的复制等。关于SUMO修饰能否调控BVDV感染尚没有报道。因此,本研究从宿主SUMO通路的角度出发,研究BVDV感染对宿主细胞的影响及其机制,这将有利于我们寻找新型的BVDV防控策略。为此,本研究以BVDV和牛胚肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney,MDBK)为研究对象,主要开展以下的研究工作:1.不同生物型BVDV感染MDBK细胞后类泛素基因转录水平的检测。培养致细胞病变型(CP型)BVDV NADL病毒和非致细胞病变型(NCP型)BVDV shz 132病毒;RT-q PCR反应测定两种病毒拷贝数;Reed-Muench法测定NADL病毒TCID50值。以100 TCID50 NADL病毒和同等拷贝数的shz 132病毒分别感染MDBK细胞不同时间(4 h、12 h、24 h、48 h),RT-q PCR反应检测细胞类泛素基因SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9的转录水平。结果显示,NADL和shz 132病毒拷贝数分别是1.13×1011copies/m L和1.77×1011copies/m L,NADL TCID50值是104.9 TCID50/0.1 m L。RT-q PCR分析显示,与对照组相比,两种BVDV病毒感染都能引起MDBK细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3、Ubc9基因的相对表达量变化。在shz 132感染的细胞中,SUMO1、SUMO2、SUMO3的相对表达量在各个感染时间都高于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24 h,以上三个基因的相对表达量下调,差异极显著(P<0.01);而Ubc9基因的相对表达量则低于或接近于BVDV NADL感染的细胞,且在感染后24 h,其相对表达量上调,差异极显著(P<0.01)。2.SUMO1和Ubc9基因对BVDV复制的影响检测。设计并合成靶向SUMO1和Ubc9基因的si RNA,构建慢病毒干扰载体,与VSVG、PMDL、Rev共转染人胚肾细胞(HEK293FT),包装为慢病毒后感染MDBK细胞。RT-q PCR检测si RNA对SUMO1和Ubc9基因的干扰效率及其对BVDV复制的影响。测序结果说明,成功构建了靶向SUMO1基因和Ubc9基因的慢病毒干扰载体。在HEK293FT细胞中成功地包装为重组慢病毒,荧光倒置显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达。RT-q PCR表明,与对照组相比,SUMO1-sh RNA-1-p LL3.7和SUMO1-sh RNA-2-p LL3.7对SUMO1基因的干扰效率分别为64%和62%;Ubc9-sh RNA-1-p LL3.7、Ubc9-sh RNA-2-p LL3.7和Ubc9-sh RNA-3-p LL3.7对Ubc9基因的干扰效率分别为0%、6%和26%。干扰MDBK细胞SUMO1基因后,病毒的拷贝数是1.1×1016copies/m L;干扰Ubc9基因后,病毒的拷贝数是1.3×1014copies/m L。3.BVDV E0蛋白与细胞类泛素蛋白的相互作用分析。PCR方法扩增细胞类泛素基因SUMO1/SUMO2/SUMO3/Ubc9,进行TA克隆,经菌液PCR、双酶切、测序鉴定,构建重组原核表达载体p GEX-4T-1-SUMO1/SUMO2/SUMO3/Ubc9,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以0.1 m M IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果。同时,诱导表达已鉴定正确的p ET-32a(+)-E0重组表达载体的转化菌,GST-pull down方法分析E0蛋白与类泛素蛋白的直接相互作用。测序结果表明,成功构建了p MD18-T-SUMO1/SUMO2/SUMO3/Ubc9克隆载体和p GEX-4T-1-SUMO1/SUMO2/SUMO3/Ubc9原核表达载体,核苷酸无突变;SDS-PAGE电泳表明,成功诱导表达了SUMO1/SUMO2/SUMO3/Ubc9-GST可溶性融合蛋白,分子量依次为37.3 k Da、36.6k Da、37.6 k Da、43.5 k Da;GST-pull down实验证明BVDV E0蛋白不能结合细胞类泛素蛋白。以上所有的研究结果表明,BVDV感染影响了MDBK细胞SUMO通路,且这种作用与病毒的生物型存在密切联系;BVDV能够利用宿主SUMO通路,以有利于病毒在胞内的生存与增殖;BVDV E0蛋白与细胞类泛素蛋白之间不存在直接相互作用。本项研究结果丰富了BVDV致病机制的理论基础,为BVDV的抗病毒感染提供科学依据。