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研究目的:对野生型ADI(wADI)进行定点突变改造,构建突变型ADI(mADI)大肠杆菌重组表达系统,筛选出高表达的重组工程菌。建立重组mADI的发酵工艺和纯化工艺。对比分析位点突变对酶活性的影响。对野生型和突变型ADI进行PEG修饰和纯化,对比分析位点突变对PEG修饰ADI的影响。研究方法:(1)ADI突变位点的设计与构建表达(1)根据支原体来源的野生型ADI蛋白序列设计大肠杆菌密码偏爱性的突变型ADI基因序列并对其全基因合成。将全基因合成的mADI插入到pET-3a,构建重组质粒pET-3a-mADI。(2)重组质粒pET-3a-mADI转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3),采用抗性筛选法获得重组工程菌。(3)摇瓶表达筛选高表达菌株并进行30L体系放大发酵表达。(2)ADI的纯化工艺和酶活性研究:(1)通过高压匀浆法破菌、包涵体洗涤、稀释复性、DEAE阴离子交换层析、Butyl疏水层析等工艺获得纯的目的蛋白。(2)对纯化后的wADI和mADI分别进行紫外法测活,对比分析位点突变对酶活性的影响。(3)ADI的PEG修饰研究:(1)采用PEG-5k对两种酶进行不同比例的修饰。(2)采用分子筛法对修饰后的样品进行纯化,获得高纯度的修饰样品。(3)采用SEC-HPLC/UV-RI紫外示差联用法测定平均修饰度,体外测活法对修饰样品测活,对比分析位点突变对PEG修饰ADI的影响。结论:经双酶切和基因测序法对构建的重组质粒进行检测,成功构建了重组表达质粒pET-3a-mADI,目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,表达量高达30%。建立并确定了mADI的摇瓶表达和发酵罐放大培养条件。探索并建立了稳定的纯化工艺,SDS-PAGE和HPLC纯度都高于95%以上。经体外测活对比分析,突变位点未对酶活性产生明显的影响。成功实现wADI和mADI不同摩尔比例的PEG修饰,并通过纯化获得各自单一的修饰产物。对比分析这两种酶进行PEG修饰前后的差异和相关性(PEG修饰个数的差异,修饰位点的差异、酶活性差异等),证明了突变位点会影响PEG与精氨酸脱亚胺酶结合,在wADI相应的位点极易被PEG修饰,而经过突变后该位点不能够被PEG修饰,在相同修饰比例下突变型精氨酸脱亚胺酶(mADI)平均修饰度均比野生型精氨酸脱亚胺酶(wADI)平均修饰度少1个,最终在酶活性上存在差异,不论相同比例下获得的修饰产物,还是不同修饰比例获得相同修饰个数得产物,突变后的PEG-mADI(m ADI)酶活均高于野生型PEG-wADI(wADI)。这为后期开发低免疫原性,高活性的精氨酸脱亚胺酶奠定了理论和实践基础。